Detection of group A beta-hemolytic Streptococcus employing three different detection methods: culture, rapid antigen detecting test, and molecular assay
ORIGINAL PAPERS
Detection of group A beta-hemolytic Streptococcus employing three different detection methods: hodowla, szybki test wykrywający antygen oraz test molekularny
Odimara SantosI; Luc Louis Maurice WeckxI; Antonio Carlos Campos PignatariII; Shirley Shizue Nagata PignatariI
IFederal University of São Paulo, Division of Pediatric Otolaryngology
IIDivision of Infectious Diseases, São Paulo, SP, Brazylia
Korespondencja
ABSTRACT
W celu zbadania częstości występowania zapalenia gardła i migdałków wywołanego przez paciorkowce beta-hemolizujące grupy A (GABHS) w naszej populacji dziecięcej i porównania różnych metod pobierania próbek w celu wykrycia GABHS, wymazy z gardła od 50 dzieci z ostrym zapaleniem gardła, w wieku od 1 do 12 lat, były używane jednocześnie do hodowli, oznaczeń molekularnych i szybkich testów wykrywających antygen GABHS. Wszystkie dzieci były badane klinicznie na Oddziale Otorynolaryngologii Dziecięcej Uniwersytetu Federalnego w São Paulo. Kryteria diagnostyczne opierały się na oznakach i objawach, w tym bólu gardła, gorączce i ropnej wydzielinie z jamy ustno-gardłowej. Wykluczono dzieci, które były leczone antybiotykami. W sumie, łącząc trzy metody, częstość występowania GABHS wynosiła 34%. GABHS został zdiagnozowany w 30% posiewów bakteryjnych, w 25% próbek badanych metodą hybrydyzacji molekularnej kwasów nukleinowych i w 26% przypadków badanych szybkim testem wykrywania antygenów. Nie stwierdzono istotnej różnicy pomiędzy tymi trzema metodami.
Key Words: Acute pharyngotonsillitis, GABHS, laboratory detection.
Pharyngotonsillitis jest jedną z najczęstszych chorób układu oddechowego w społeczeństwie, szczególnie w okresie dzieciństwa. Szacuje się, że około 28% do 40% tych zakażeń jest wywoływanych przez paciorkowca beta-hemolizującego grupy A (Group A beta-hemolytic Streptococcus – GABHS), który jest uważany za najważniejszy patogen etiologiczny pod względem następstw i powikłań. Ponieważ paciorkowcowe zapalenie gardła i migdałków może prowadzić do choroby reumatycznej i jej następstw oraz do powikłań ropnych, stanowi ono potencjalnie poważny problem medyczny, a odpowiednie leczenie jest niezbędne.
Pomimo wielu prób klinicznego różnicowania paciorkowcowego zapalenia gardła i migdałków z infekcjami wirusowymi, jak dotąd żadna metoda nie okazała się wiarygodna. Ze względu na brak odpowiedniej podstawy klinicznej do rozpoznania GABHS pharyngotonsillitis, ważne jest, aby znaleźć łatwy, praktyczny i opłacalny sposób zapewnienia takiego rozróżnienia.
W ciągu ostatnich pięćdziesięciu lat hodowla bakterii była główną techniką stosowaną do diagnozowania GABHS. W 1980 roku, Centrum Kontroli Chorób (CDC) oszacowało, że każdego roku w USA wykonywano od 28 do 36 milionów posiewów z gardła. Hodowla gardła jest nadal uważana za „złoty standard” w wykrywaniu GABHS, dając pozytywne wyniki w około 90% do 99% przypadków .
W wielu krajach bardzo popularne stało się stosowanie szybkich testów do wykrywania GABHS bezpośrednio z wymazów z gardła. Większość z tych testów wykorzystuje metody aglutynacji lateksowej lub enzymatycznej próby immunologicznej do wykrywania antygenu węglowodanowego Grupy A Streptococcus pyogenes .
Choć testy hybrydyzacji molekularnej nie są tak popularne, wykazano, że mają one wysoki poziom swoistości i czułości .
Aby określić częstość występowania infekcji gardła GABHS i znaleźć najlepszy sposób na postawienie tej diagnozy, ocenialiśmy dzieci z ostrym zapaleniem gardła i porównywaliśmy trzy różne metody wykrywania GABHS z wymazów z gardła: kulturę w blood-agar, szybki test wykrywania GABHS i test hybrydyzacji kwasu nukleinowego GABHS.
Materiały i metody
Pięćdziesięcioro dzieci z ostrym zapaleniem gardła i migdałków, w wieku od 1 do 12 lat, zostało ocenionych na Oddziale Otorynolaryngologii Dziecięcej Uniwersytetu Federalnego w São Paulo, Brazylia, w latach 1998-2001. Kryteria diagnostyczne i wybór opierały się na objawach klinicznych, w tym bólu gardła, gorączce, zapaleniu węzłów chłonnych szyjnych i ropnej wydzielinie z jamy ustno-gardłowej. Rodzice lub opiekunowie prawni podpisali świadomą zgodę.
Wymazy z jamy ustno-gardłowej pobierano jednocześnie do trzech metod wykrywania:
1. Kultura. Próbki z gardła pobierano za pomocą „Starswab” (Laborclin®), natychmiast transportowano do Laboratorium Mikrobiologicznego i rozprowadzano na płytce z 5% agarem z krwią (Columbia agar-base, Oxoid), a następnie inkubowano przez 18-24 godziny w temperaturze 36oC w środowisku 5% CO2. W celu identyfikacji GABHS wykonywano testy biochemiczne, testy aglutynacji antysurowicowej oraz testy wrażliwości na optochinę/bacytracynę.
2. Próbki do szybkiego testu wykrywającego (Test Pack® Strep A Abbott) pobierano w wymazach alginianowych. Wszystkie testy zostały wykonane „in loco”, zgodnie z metodą dostarczoną przez producenta. Szybki test wykrywający (Abbott) oparty jest na wykrywaniu antygenu GABHS poprzez reakcję aglutynacji antygen-AC ELISA.
3. Identyfikacja GABHS za pomocą testu hybrydyzacji kwasów nukleinowych (GEN-PROBEâ INCORPORATED, San Diego, California AccuPACE TEST DO IDENTYFIKACJI GRUPY A STREPTOCOCCUS) zgodnie ze specyfikacją producenta. Alginowane wymazy były inokulowane do Tryptic Soy Broth i inkubowane w temperaturze 36oC przez 18 do 24 godzin, w środowisku wzbogaconym w CO2. Wyniki uzyskano metodą chemiluminescencji. Wartości 20,000 względnych jednostek luminescencji (RLU) lub wyższe uznawano za pozytywne; poniżej 15,000 RLU uznawano za negatywne, a pomiędzy 15,000 a 19,999 za słabo pozytywne.
Wyniki
Powszechność Streptococcus pyogenes wynosiła 34% (17 przypadków) przy zastosowaniu kombinacji trzech metod. GABHS wykryto w 30% (15 przypadków) posiewów, 26% (12 przypadków) za pomocą testów molekularnych i 26% (13 przypadków) za pomocą szybkiego testu identyfikacyjnego (Tabela 1).
Uważając wynik hodowli jako parametr „złotego standardu”, szybki test dał czułość 73% (przypadki dodatnie w porównaniu z całkowitą liczbą przypadków dodatnich uzyskanych przez hodowlę) i swoistość 94% (wyniki ujemne w porównaniu z całkowitą liczbą przypadków ujemnych uzyskanych przez hodowlę), pozytywną wartość predykcyjną 85% i negatywną wartość predykcyjną 88% (Tabela 2).
Testy molekularne (kwaśne testy hybrydyzacji nukleinowej) wykonano dla 47 próbek. Zgodność wyników przy zastosowaniu różnych metod wystąpiła w 76% przypadków. W czterech próbkach (8,5%) test molekularny był dodatni, podczas gdy hodowla była ujemna.
Dyskusja
Streptokokowe zapalenie gardła i migdałków od lat jest przedmiotem zainteresowania lekarzy, szczególnie ze względu na możliwość wywoływania poważnych problemów, takich jak gorączka reumatyczna i powikłania ropne. Częstość występowania ostrego zapalenia gardła i migdałków spowodowanego przez GABHS wynosi około 28% do 40% na całym świecie; wiadomo, że większość z nich jest wrażliwa na penicylinę. Odsetek ten różni się również w zależności od regionu .
Powszechność GABHS w São Paulo, Brazylia wydaje się być podobna do danych międzynarodowych, ponieważ ogólnie, GABHS stwierdzono u 34% dzieci. Te izolaty GABHS były również wrażliwe na penicylinę (dane nie pokazane).
Niewiarygodność diagnozy opartej na podstawach klinicznych, była jednym z czynników ograniczających odpowiednie zarządzanie tą chorobą, szczególnie w krajach rozwijających się, gdzie szybkie testy wykrywające lub nawet hodowle bakteryjne nie zawsze są dostępne. Obecnie w wielu krajach dostępnych jest wiele komercyjnych zestawów testowych do szybkiej diagnostyki paciorkowcowego zapalenia gardła i migdałków grupy A, a najnowsze z nich oparte są na metodach immunologicznych. Ich swoistość sięga około 89-99%, a czułość waha się pomiędzy 77 a 98%, biorąc pod uwagę hodowlę bakteryjną jako parametr „złotego standardu”. Większość z tych testów może być wykonywana „in loco”, a wyniki są dostępne w ciągu około 15 minut.
W krajach, w których rutynowo stosuje się szybkie testy wykrywające, istnieje kontrowersja dotycząca tego, czy konieczna jest hodowla potwierdzająca, gdy wyniki są ujemne. Chociaż większość lekarzy zazwyczaj nie stosuje tej procedury, większość towarzystw medycznych zaleca wykonywanie hodowli potwierdzających. Zastosowanie szybkiego testu wykrywającego oraz hodowli bakteryjnej w przypadku wyników ujemnych jest obecnie uważane za najbardziej efektywną strategię kliniczną, zwiększającą koszty krańcowe tylko nieznacznie (zwiększa koszty początkowe, ale obniża koszty całkowite, jeśli weźmiemy pod uwagę zapobieganie powikłaniom niewykrytych przypadków nieleczonych szybkim testem) .
Połączenie tych trzech metod, częstość występowania Streptococcus pyogenes w tym badaniu była nieznacznie wyższa niż w naszym poprzednim badaniu, w którym metodą stosowaną była hodowla bakteryjna. W naszym badaniu, przeprowadzonym w 1996 roku, 18% posiewów od 44 dzieci z infekcją jamy ustno-gardłowej miało GABHS .
Mimo, że w naszym obecnym badaniu metoda oznaczeń molekularnych była w stanie wykryć GABHS w niektórych przypadkach z ujemnymi wynikami hodowli, była ona czasochłonna i kosztowna. Pokorski i wsp. (1994), w badaniu 767 pacjentów z zapaleniem gardła, czułość metody molekularnej wynosiła 85,7%, a specyficzność 97,8%, w porównaniu do 96,7% czułości i 100% specyficzności w przypadku posiewów bakteryjnych.
Według analizy kosztów i korzyści, leczenie wszystkich pacjentów, bez wcześniejszej hodowli lub badania, zapobiegłoby 90% potencjalnych powikłań, zmniejszając ogólne koszty. Z drugiej strony, wystąpiłoby więcej działań niepożądanych związanych z antybiotykami, a ich stosowanie byłoby w większości przypadków zbędne. W każdym przypadku, gdy wybrany jest izolowany szybki test wykrywający (bez zapasowej kultury), korzyści z kosztów i korzyści mogą być znaczące, jeśli czułość testu i wskaźnik follow-up są wysokie .
Chociaż kilka badań wykazało, że szybki test, stosowany samodzielnie, nie ma wystarczającej czułości, aby wyeliminować potrzebę kultur , niektórzy badacze wykazali, że ostatnio dostępne szybkie testy mogą być bardziej czułe niż kultura bakteryjna, szczególnie testy oparte na testach immunologicznych, które mogą dać wyniki w ciągu kilku minut .
Interesująco, kultura bakteryjna została uznana przez wielu za „złoty standard” metody wykrywania GABHS, jednak zgodnie z ostatnimi badaniami, byłby to wybór wysokich kosztów w stosunku do jego skuteczności .
Ogółem, stwierdziliśmy, że częstość występowania GABHS w naszej populacji jest podobna do danych międzynarodowych, około 30%. Nie stwierdziliśmy również istotnych różnic w czułości lub swoistości przy porównaniu wykrywania szybkim testem z wynikami hodowli bakteryjnej.
Z powodu wyższych kosztów oraz znacznego czasu i pracy związanej z metodą molekularną, nie zalecalibyśmy jej do rutynowego stosowania.
Mimo znacznego zróżnicowania ekonomicznego i społecznego istniejącego w naszym kraju, gdzie często techniki szybkiego testu lub nawet hodowli bakteryjnej nie są dostępne, co może prowadzić lekarzy do różnych opcji zarządzania, w tym leczenia pacjenta opartego tylko na założeniach klinicznych, uważamy, że obiektywne procedury diagnostyczne, takie jak szybki test lub hodowle bakteryjne, powinny być stymulowane.
Podziękowania
Dziękujemy panu Marcelowi Frederico de Lima Taga z Dept. of Preventive Medicine, Biostatistical Division, UNIFESP (São Paulo) za jego uprzejmość w pomaganiu nam w analizach statystycznych. Dziękujemy również dr Lee Harker; zastępcy dyrektora Boystown R.C. (Omaha) za pomoc w korekcie tekstu. Praca ta została przedstawiona na spotkaniu American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Meeting, które odbyło się w San Diego, Kalifornia, USA, (22-25 września 2002 r.).
1. Pichicheri M.E. Group A Streptococcal tonsillopharyngitis: Cost-effective diagnosis and treatament. Ann Emerg Med 1995;25:390-403.
2. Funamuta J.L, Berkowitz C.D. Applicability of a scoring system in the diagnosis of streptococcal pharyngitis. Clin Pediatr 1983;22:622-9.
3. Mackin M., Hall G., Rutherford I. Three simultaneously obtained throat cultures for beta-hemolytic group A Streptococcus. Pediatr Infect Dis J 1987;6:575-6.
4. Dale J.C., Vetter E.A., Contezac J.M., et al. Evaluation of two rapid antigen assays, BioStar Strep A OIA and Pacific Biotech CARDS OS, and culture for detection of Group A Streptococci in throat swabs. J Clin Microbiolol 1994;32:2698-701.
5. Schager T.A, Hayden G.A, Woods W.A, et al. Optical immunoassay for rapid detection of Group A b-hemolytic Streptococci. Should culture be replaced? Arch Pediatr Adolesc Med 1996;150: 245-8.
6. Gerber M.A., Tanz R.R., Kabat W., et al. Optical Immunoassay test for Group A b-hemolytic Streptococcal pharyngitis. An office-bases, multicenter investigation. JAMA 1997;277:899-903.
7. Roe M., Kishiyama C., Davidson K., et al. Comparison of BioStar strep A OIA optical immunoassay, Abbott TestPack Plus Strep A, and culture with selective media for diagnosis of Group A Streptococcal pharyngitis. J Clin Microbiol 1995; 33:1551-3.
8. Pokirski S.J., Vetter E.A, Wollan P.C., Cockerill F.R. Comparasion of gen-probe Group A Streptococcus direct test with culture for diagnosing Streptococcal pharyngitis. J Clin Microbiol 1994;32: 1440-3.
9. Schwartz B., Fries S., Fizgibbon A., Lipman H. Pediatrician’s diagnostic approach to pharyngitis and impact of CLIA 1988 on office diagnostic tests. JAMA 1994;271:234-8.
10. Lieu T.A, Fleisher G.R., Schwart J.S. Cost-Effectiveness of rapid latex agglutination testing and throat culture for Streptococcal pharyngitis. Pediatrics 1990;85:246-56.
11. Pignatari S.N., Santos O.P., Sader H., et al. Estudo microbiológico de amigdalites agudas em crianças. Anais do XXXIII Congresso Brasileiro de Otorrinolaringologia; IV Congresso Norte-Nordeste de Otorrinolaringologia; 1996.