Heterogenní skupina
2.2 Pektinázy
Pektinázy tvoří heterogenní skupinu enzymů, které rozkládají složité polysacharidy rostlinných tkání na jednodušší molekuly, jako jsou kyseliny galakturonové. Jejich komerční využití bylo poprvé pozorováno v roce 1930 při přípravě vín a ovocných šťáv . Na celosvětovém prodeji potravinářských enzymů se podílejí 25 % a průmyslově se využívají při extrakci, čiření a zahušťování ovocných šťáv, čiření vín a extrakci olejů, aromat a pigmentů z rostlin . Tyto enzymy zahrnují protopektinázy, polygalakturonázy, lyázy a pektinesterázy na základě jejich způsobu účinku. Protopektinázy katalyzují solubilizaci protopektinu. Polygalakturonasy hydrolyzují řetězec kyseliny polygalakturonové přidáním vody a jsou nejrozšířenější ze všech pektinolytických enzymů. Lyasy katalyzují trans-eliminativní štěpení polymeru kyseliny galakturonové. Pektinesterasy uvolňují pektiny a methanol deesterifikací metylesterových vazeb pektinové páteře .
Jak je znázorněno v tabulce 15.1, bylo navrženo použití SSF pro výrobu pektinasy s použitím různých pevných zemědělských a zemědělsko-průmyslových zbytků jako substrátů . Houby rodu Aspergillus jsou jedním z nejdůležitějších zdrojů těchto enzymů. Taşkin et al. provedli screening několika kmenů Aspergillus izolovaných z vinic pro produkci pektináz (polygalakturonázy a polymethylgalakturonázy) a zjistili, že SSF je pro produkci pektináz lepší než SmF. Podobně Solis-Pereira a kol. zjistili, že regulační jevy, jako je indukce-represe nebo aktivace-inhibice související se syntézou pektinázy pomocí A. niger CH4, se u obou typů fermentace liší, přičemž dosáhli celkové produktivity SSF, která byla 18,8krát a 4,9krát vyšší pro endo- a exopektinázu než u SmF. Kromě toho Acuña-Arguelles a kol. porovnávali vlastnosti endo- a exopektinázy a pektinolýzy produkované technikami SSF a SmF z A. niger CH4. Zjistili, že kinetické a fyzikálně-chemické vlastnosti těchto enzymů se liší v závislosti na typu fermentace. Při SSF byly všechny pektinázové aktivity stabilnější při extrémních hodnotách pH a teploty. Kromě toho elektroforézní studie různých enzymatických extraktů získaných pro obě kultivační metody ukázala stejný počet na proteinových pásech, ale s určitými rozdíly v jejich elektroforetické poloze, což naznačuje, že kultivační metoda může být zodpovědná za vyvolání změn v některých pektinolytických enzymech produkovaných A. niger.
Výběr vhodného nosiče pro provádění SFF je zásadní, protože na něm závisí úspěch procesu. Substráty pro SSF vyžadují vlastnosti ve vztahu k chemickému složení odpadu (sacharidy, zdroj dusíku, minerální soli atd.) a jeho fyzikální vlastnosti pro dobrý růst vláknité houby nad odpadem. Obr. 15.3 ukazuje, jak houba Trichoderma longibrachiatum roste na pevném substrátu, a je zřejmé, že velikost částic a pórovitost substrátu mohou ovlivnit průběh toku a distribuci živin. Malé částice nebo částice s velkým plochým povrchem mají tendenci se na sebe těsně nabalovat, což ztěžuje provzdušňování hmoty substrátu. Pokud může mikroorganismus proniknout do částic, zvětší se tím přímo přístupný substrát a sníží se vzdálenost, na kterou musí dojít k difuzi. Proto optimální velikost částic často představuje kompromis mezi přístupností živin a dostupností kyslíku .
Obrázek 15.3. Obrázek z elektronické skenovací mikroskopie Trichoderma longibrachiatum pěstované na polyamidovém vlákně používaném jako nosič při fermentaci v pevné fázi.
Pro SSF obsahuje několik zbytků agroprůmyslu, například pomerančová a citronová kůra, cenné množství pektinu, který funguje jako nosič a induktor. Citrusová kůra, hlavní pevný vedlejší produkt ovocnářského průmyslu, tvoří přibližně 50 % hmotnosti čerstvého ovoce. Citronová kůra je tedy hlavním pevným vedlejším produktem vznikajícím při zpracování citronů a tvoří asi 19,8 % sušiny citronu . Z tohoto důvodu se likvidace těchto zbytků a nakládání s nimi stává pro průmysl vážným problémem. Alternativou k likvidaci slupek je jejich využití jako substrátu pro produkci vysokého množství pektinolytických enzymů .
Ruiz et al. studovali produkci pektinázy osmi různými houbovými kmeny z rodů Aspergillus a Penicillium v podmínkách SSF, přičemž jako substrát použili výlisky z citronových slupek, přičemž nejlepším kmenem byl A. niger Aa-20 . Stanovili význam výběru velikosti částic a provedli SSF v bioreaktoru se sloupcovou vaničkou při 30 °C, 70% vlhkosti, průtoku vzduchu 194 ml/min a velikosti částic substrátu (2-0,7 mm) z výlisků citronových slupek po dobu 96 hodin. Za těchto podmínek dosáhly maximální pektinázové aktivity kolem 2181 U/l, což naznačuje tento postup jako velmi slibnou alternativu pro produkci pektináz.
V několika studiích bylo zaznamenáno zvýšení úrovně produkce pektináz, když byly agroprůmyslové zbytky doplněny o další zdroje uhlíku a dusíku. Například Patil a Dayanand uvedli, že doplnění sacharosy v citronové kůře, stonku čiroku a slunečnicové hlávce pro produkci pektinasy A. niger DMF 27 a A. niger DMF 45 v SSF bylo účinnější než glukosa. Dále si také všimli, že ze zdrojů dusíku zvýšil úroveň produkce pektináz ze všech substrátů síran amonný .
Na druhé straně byla SSF prováděna také s použitím konvenčního substrátu, jako jsou pšeničné otruby, a doplněna pomerančovou kůrou jako induktorem. Liu et al. zlepšili produkci extracelulární pektinázy nově izolovaným kmenem A. niger JL-15 optimalizací podmínek SSF pomocí metodologie povrchu odezvy. Maximální pektinázová aktivita byla čtyřikrát vyšší než u základního média, přičemž optimální parametry byly 12,10 % prášku z pomerančové kůry, 3,20 % síranu amonného využívajícího pšeničné otruby jako pevný substrát, 51,10 % vlhkosti a 75 h fermentace. Podobně Li et al. určili, že nejlepšími substráty pro produkci pektinázy jsou pomerančové slupky a pšeničné otruby, a Diaz et al. prokázali pozitivní účinek použití směsi hroznových výlisků a pomerančových slupek.
Existuje jen málo návrhů bioreaktorů pracujících v SSF při výrobě pektinázy ve velkém měřítku. Huerta a kol. původně prováděli SSF s A. niger v bioreaktoru s plným ložem o kapacitě od 10 do 25 kg sušiny, přičemž jako zdroje uhlíku používali výlisky z cukrové třtiny impregnované živným roztokem, který obsahoval sacharosu a citrusový pektin. On a Chen uvedli, že plynová dvojdynamická SSF nabízí větší výhody než statická SSF při přípravě průmyslových enzymů, jako je pektináza, glukoamyláza, proteáza a celulóza, díky lepší aktivitě enzymů a zkrácení doby fermentace. V tomto bioreaktoru o objemu 800 l obsahovalo pevné médium 90 % pšeničných otrub, 5 % rýžových otrub, 2 % prášku z citrusových slupek a 3 % kukuřičné mouky a byly použity různé poměry tekutého a pevného média (0,7, 1,0 a 1,3 (w/w)). Pitol a kol. škálovali produkci pektinázy A. niger při SSF v bioreaktorech s balenou vrstvou z 12 g sušiny v laboratorním měřítku na 20-30 kg sušiny v pilotním měřítku. Na základě získaných informací, jako je míra spotřeby O2 a rozložení teploty a pektinázové aktivity, navrhli autoři životaschopnou strategii pro škálování procesu až na průmyslovou úroveň .
Použití extrémních enzymů (alkalofilních, termostabilních atd.) pektináz přitahuje značnou pozornost vzhledem k potenciálu pro průmyslové aplikace. Vysoká stabilita a aktivita při vysoké teplotě a v alkalickém prostředí se tak staly žádoucími vlastnostmi enzymů pro průmyslové zpracování. Z izolovaného kmene B. subtilis byla za použití kombinací levných zemědělských zbytků (pšeničných otrub a bavlníkových výlisků, pšeničných otrub a citrusového odpadu, pšeničných otrub a alfa-alfa listů, bavlníkových výlisků a citrusového odpadu, bavlníkových výlisků a alfa-alfa listů, citrusového odpadu a alfa-alfa listů, směsi čtyř substrátů) produkována alkalofilní pektináza s vysokým obsahem. Nejlepších hodnot však bylo dosaženo, když byla jako substrát použita směs pšeničných otrub a citrusového odpadu s přídavkem kvasnicového extraktu, což je v souladu s předchozími studiemi uvedenými dříve.
Termostabilní enzymy mohou být produkovány termofilními kmeny, jako je izolovaný termofil Thermoascus aurantiacus 179-5, který byl schopen produkovat vysoké hodnoty pektinolýzy a polygalakturonázy během SSF s použitím pomerančové výdrože a pšeničných otrub jako zdrojů uhlíku. Tyto enzymy vykazovaly teplotní optimum kolem 65 °C s dobrou termostabilitou, zejména pektin lyasa, která byla stabilní po dobu 5 h při 60 °C . Kaur a Saryanarayana zjistili, že ze čtyř termofilních plísní produkuje Sporotrichum thermophile po 4 dnech inkubace v SSF vysokou koncentraci xylanasy, pektinasy a celulasy. Zkoušené kombinace agroreziduí byly pšeničné otruby a citrusový pektin v poměru 1:1. V jiné studii Martin a kol. izolovali 34 termofilních a termotolerantních houbových kmenů z půdy, organického kompostu a průmyslového odpadu za použití kultivačního média obsahujícího pektin jako jediný zdroj uhlíku. Všechny tyto izolované kmeny, které byly na rodové úrovni identifikovány jako Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis a Thermomucor, produkovaly během SSF pektinasu. Například když byl Thermomucor indicae seudaticae kultivován v podmínkách SSF na médiu obsahujícím směs pšeničných otrub a pomerančové bagasy (1:1) při 70 % počáteční vlhkosti, maximální aktivita polygalakturonázy byla 120 U/ml, zatímco v SmF produkoval pouze 13,6 U/ml.
.