Grupo Heterogéneo
2.2 Pectinases
Pectinases constituem um grupo heterogéneo de enzimas que decompõem polissacáridos complexos de tecidos vegetais em moléculas mais simples como os ácidos galacturónicos. Sua aplicação comercial foi observada pela primeira vez em 1930 para o preparo de vinhos e sucos de frutas. Eles têm uma participação de 25% nas vendas globais de enzimas alimentares e são empregados industrialmente na extração, clarificação e concentração de sucos de frutas; na clarificação de vinhos; e na extração de óleos, aromas e pigmentos de plantas. Estas enzimas incluem protopectinases, poligalacturonases, lisases e pectinesterases com base no seu modo de acção. As protopectinases catalisam a solubilização da protopectina. As poligalacturonases hidrolisam a cadeia do ácido poligalacturónico por adição de água e são as mais abundantes entre todas as enzimas pectinolíticas. As lioases catalisam a clivagem trans-eliminativa do polímero do ácido galacturónico. As pectinesterases liberam pectinas e metanol, desesterificando as ligações de ésteres metílicos da espinha dorsal da pectina .
Como ilustrado na Tabela 15.1, o uso de SSF para a produção de pectinase tem sido proposto usando diferentes resíduos sólidos agrícolas e agro-industriais como substratos . Os fungos do gênero Aspergillus são uma das mais importantes fontes destas enzimas. Taşkin et al. rastrearam várias cepas de Aspergillus isoladas das vinhas para a produção de pectinase (poligalacturonase e polimetilgalacturonase) e determinaram que a SSF era melhor que a SmF para a produção de pectinase. Da mesma forma, Solis-Pereira et al. determinaram que fenômenos regulatórios, como a indução-repressão ou a inibição de ativação-inibição relacionados à síntese de pectinase por A. niger CH4 são diferentes nos dois tipos de fermentação, atingindo produtividades globais de SSF que foram 18,8 e 4,9 vezes maiores para a endo e exopectinase, respectivamente, do que as do SmF. Além disso, Acuña-Arguelles et al. compararam as propriedades da endo- e exopectinase e pectin lyase produzidas pelas técnicas SSF e SmF de A. niger CH4. Observaram que as propriedades cinéticas e físico-químicas destas enzimas eram diferentes, dependendo do tipo de fermentação. Assim, na SSF todas as atividades da pectinase foram mais estáveis em valores extremos de pH e temperatura. Além disso, o estudo eletroforese dos diferentes extratos enzimáticos obtidos para ambos os métodos de cultura mostrou o mesmo número em faixas protéicas, mas com algumas diferenças em sua posição eletroforética que sugerem que o método de cultura pode ser responsável por induzir mudanças em algumas das enzimas pectinolíticas produzidas por A. niger.
A seleção de um suporte adequado para a realização da SFF é essencial, uma vez que o sucesso do processo depende disso. Os substratos de SSF requerem características em relação à composição química dos resíduos (carboidratos, fonte de nitrogênio, sais minerais, etc.) e suas propriedades físicas para um bom crescimento de fungos filamentosos sobre os resíduos. A figura 15.3 mostra como o fungo Trichoderma longibrachiatum cresce no substrato sólido e é óbvio que o tamanho das partículas e a porosidade no substrato podem afetar o padrão de fluxo e a distribuição dos nutrientes. Partículas pequenas, ou partículas com grandes superfícies planas, tendem a se empacotar juntas, tornando difícil o arejamento da massa do substrato. Se o microrganismo puder penetrar na partícula, isto aumenta o substrato directamente acessível e diminui a distância ao longo da qual a difusão necessita de ocorrer. Portanto, o tamanho ideal das partículas frequentemente representa um compromisso entre a acessibilidade dos nutrientes e a disponibilidade de oxigénio .
Figure 15.3. Imagem de microscopia eletrônica de varredura de Trichoderma longibrachiatum cultivado em fibra de poliamida usada como suporte na fermentação em estado sólido.
Para SSF, vários resíduos de agroindústrias como casca de laranja e casca de limão contêm valiosa quantidade de pectina, que atua como suporte e indutor. A casca de citrinos, o principal subproduto sólido das indústrias de processamento de fruta, constitui cerca de 50% do peso da fruta fresca. Assim, a casca do limão é o principal subproduto sólido resultante da indústria de processamento de limão e constitui cerca de 19,8% da massa seca do limão. Por este motivo, a eliminação e gestão destes resíduos torna-se um grave problema para as indústrias. Como alternativa à disposição das cascas, elas podem ser utilizadas como substrato para a produção de altos níveis de enzimas pectinolíticas .
Ruiz et al. estudaram a produção de pectinase por oito diferentes cepas fúngicas dos gêneros Aspergillus e Penicillium sob SSF usando como substrato o bagaço de casca de limão com A. niger Aa-20 sendo a melhor cepa. Eles determinaram a importância da seleção do tamanho da partícula e realizaram o SSF em um biorreator de coluna a 30°C, 70% de umidade, 194 mL/min de fluxo de ar e o tamanho da partícula do substrato (2-0,7 mm) de resíduo de casca de limão durante 96 h. Nestas condições alcançaram uma atividade máxima de pectinase em torno de 2181 U/L, o que sugere este processo como uma alternativa muito promissora para a produção de pectinase.
Em vários estudos foi observado o aumento do nível na produção de pectinases quando os resíduos agro-industriais foram suplementados com fontes adicionais de carbono e nitrogênio. Por exemplo, Patil e Dayanand relataram que a suplementação de sacarose em casca de limão, caule de sorgo e cabeça de girassol para a produção de pectinase por A. niger DMF 27 e A. niger DMF 45 em SSF foi mais eficaz do que a glicose. Além disso, eles também notaram que entre as fontes de nitrogênio, o sulfato de amônio elevou o nível de produção de pectinases de todos os substratos .
Por outro lado, SSF também foi realizado usando um substrato convencional como farelo de trigo e suplementado com casca de laranja como indutor. Liu et al. melhoraram a produção de pectinase extracelular através de uma cepa A. niger JL-15 recentemente isolada, otimizando as condições da SSF pela metodologia de superfície de resposta. A atividade máxima da pectinase foi quatro vezes maior que a do meio básico sendo os parâmetros ótimos 12,10% de casca de laranja em pó, 3,20% de sulfato de amônio empregando farelo de trigo como substrato sólido, 51,10% de umidade e 75 h de fermentação. Da mesma forma, Li et al. determinaram que casca de laranja e farelo de trigo foram os melhores substratos para a produção de pectinase e Diaz et al. demonstraram o efeito positivo de usar uma mistura de bagaço de uva e casca de laranja.
Existem poucos projetos disponíveis para biorreatores operando em SSF em uma produção de pectinase em larga escala. Inicialmente Huerta et al. conduziram SSF com A. niger em um biorreator de leito embalado com capacidade de 10 a 25 kg de matéria seca usando como fontes de carbono bagaço de cana impregnado com uma solução nutriente que continha sacarose e pectina cítrica. Ele e Chen relataram que o SSF gasodinâmico duplo ofereceu maiores vantagens ao SSF estático na preparação de enzimas industriais tais como pectinase, glucoamilase, protease e celulose devido à melhoria das atividades enzimáticas e à redução do tempo de fermentação. Neste biorreator de 800 L, o meio sólido continha 90% de farelo de trigo, 5% de farelo de arroz, 2% de casca cítrica e 3% de farinha de milho, e diferentes proporções líquido-sólido do meio (0,7, 1,0 e 1,3 (p/p)) foram utilizadas. Pitol et al. escalaram a produção de pectinase por A. niger durante a SSF em bioreatores de cama de 12 g de matéria seca em escala de laboratório para 20-30 kg de matéria seca em escala piloto. A partir das informações obtidas, como a taxa de consumo de O2 e a distribuição da temperatura e da atividade da pectinase, os autores propuseram uma estratégia viável para dimensionar o processo até o nível industrial .
O uso de enzimas extremófilo (alcalofílicas, termoestáveis, etc.) pectinases tem atraído considerável atenção devido ao potencial para aplicações industriais. Assim, a elevada estabilidade e actividade a altas temperaturas e ambientes alcalinos tornaram-se propriedades enzimáticas desejáveis para o processamento industrial. Um alto nível de pectinase alcalofílica foi produzido a partir de uma cepa isolada de B. subtilis sob SSF usando combinações de resíduos agrícolas baratos (farelo de trigo e bolo de semente de algodão, farelo de trigo e resíduos cítricos, farelo de trigo e folhas alfa alfa, bolo de semente de algodão e resíduos cítricos, bolo de semente de algodão e folhas alfa alfa, resíduos cítricos e folhas alfa alfa, uma mistura dos quatro substratos). Entretanto, os melhores níveis foram obtidos quando uma mistura de farelo de trigo e resíduos cítricos com um suplemento de extrato de levedura foi usada como substrato, o que está de acordo com os estudos anteriores relatados anteriormente.
Enzimas termoestáveis podem ser produzidas por cepas termofílicas como termófilo isolado, Thermoascus aurantiacus 179-5, que foi capaz de produzir altos níveis de pectin lyase e poligalacturonase durante a SSF usando bagaço de laranja e farelo de trigo como fontes de carbono. Estas enzimas apresentaram uma temperatura ótima em torno de 65°C com boa termoestabilidade, especialmente a pectin lyase, que foi estável por 5 h a 60°C . Kaur e Saryanarayana descobriram que entre quatro moldes termofílicos, o Sporotrichum thermophile produziu uma alta concentração de xilanases, pectinases e celulases após 4 dias de incubação na SSF. As combinações de agro-resíduos tentadas foram farelo de trigo e pectina cítrica na proporção de 1:1. Em outro estudo, Martin et al. isolaram 34 cepas de fungos termofílicos e termotolerantes do solo, composto orgânico e resíduos industriais usando um meio de cultura contendo pectina como a única fonte de carbono. Todas essas cepas isoladas, que foram identificadas a nível de gênero como Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis e Thermomucor, produziram pectinase durante a SSF. Por exemplo, quando Thermomucor indicae seudaticae foi cultivada sob condições SSF em meios contendo uma mistura de farelo de trigo e bagaço de laranja (1:1) a 70% da umidade inicial, a atividade máxima da poligalacturonase foi de 120 U/mL, enquanto em SmF produziu apenas 13,6 U/mL.