Heterogén csoport
2.2 Pektinázok
A pektinázok az enzimek heterogén csoportját alkotják, amelyek a növényi szövetek komplex poliszacharidjait egyszerűbb molekulákra, például galakturonsavakra bontják. Kereskedelmi alkalmazásukat először 1930-ban figyelték meg borok és gyümölcslevek készítésénél . Az élelmiszeripari enzimek globális értékesítésében 25%-os részesedéssel bírnak, és iparilag gyümölcslevek kivonásában, tisztításában és koncentrálásában, borok tisztításában, valamint olajok, aromák és pigmentek kivonásában alkalmazzák őket növényekből. Ezek az enzimek hatásmechanizmusuk alapján protopektinázok, poligalakturonázok, liázok és pektinészterázok. A protopektinázok a protopektin szolubilizációját katalizálják. A poligalakturonázok víz hozzáadásával hidrolizálják a poligalakturonsavláncot, és az összes pektinolitikus enzim közül a legnagyobb mennyiségben fordulnak elő. A liázok a galakturonsav-polimer transz-eliminatív hasítását katalizálják. A pektinészterázok pektineket és metanolt szabadítanak fel a pektin gerinc metilészter kötéseinek de-észteresítésével .
Amint azt a 15.1. táblázat mutatja, az SSF használatát javasolták pektináz előállítására különböző szilárd mezőgazdasági és agro-ipari maradékanyagok szubsztrátként történő felhasználásával . Az Aspergillus nemzetséghez tartozó gombák az egyik legfontosabb forrása ezeknek az enzimeknek. Taşkin és munkatársai több, szőlőültetvényekről izolált Aspergillus törzset vizsgáltak pektináztermelésre (poligalakturonáz és polimetilgalakturonáz), és megállapították, hogy az SSF jobb pektináztermelésre, mint az SmF. Hasonlóképpen Solis-Pereira és munkatársai megállapították, hogy az A. niger CH4 által végzett pektinázszintézishez kapcsolódó szabályozási jelenségek, mint például az indukció-represszió vagy az aktiválás-gátlás, eltérőek a két fermentációs típusban, és az SSF esetében 18,8, illetve 4,9-szer nagyobb össztermékenységet értek el az endo- és exopektináz esetében, mint az SmF esetében. Ezenkívül Acuña-Arguelles és munkatársai összehasonlították az A. niger CH4-ből SSF és SmF technikával előállított endo- és exopektináz és pektin-liáz tulajdonságait. Megfigyelték, hogy ezen enzimek kinetikai és fizikai-kémiai tulajdonságai eltérőek voltak a fermentáció típusától függően. Így SSF-ben az összes pektináz aktivitás stabilabb volt szélsőséges pH- és hőmérsékleti értékeken. Ezen kívül a két tenyésztési módszerrel nyert különböző enzimkivonatok elektroforézises vizsgálata azonos számú fehérjesávot mutatott, de némi különbséggel az elektroforetikus helyzetükben, ami arra utal, hogy a tenyésztési módszer felelős lehet az A. niger által termelt egyes pektinolitikus enzimek változásainak előidézéséért.
A megfelelő hordozó kiválasztása az SFF elvégzéséhez alapvető fontosságú, mivel a folyamat sikere ettől függ. Az SSF szubsztrátoknak a hulladék kémiai összetételével (szénhidrátok, nitrogénforrás, ásványi sók stb.) és fizikai tulajdonságaival kapcsolatos tulajdonságokra van szükségük ahhoz, hogy a fonalas gomba jól növekedjen a hulladékon. A 15.3. ábra azt mutatja, hogy a Trichoderma longibrachiatum gomba hogyan növekszik a szilárd szubsztrátumon, és nyilvánvaló, hogy a szubsztrátum részecskemérete és porozitása befolyásolhatja az áramlási mintázatot és a tápanyageloszlást. A kis részecskék, vagy a nagy sík felületű részecskék hajlamosak szorosan egymás mellé tömörülni, ami megnehezíti a szubsztrát tömegének levegőztetését. Ha a mikroorganizmus be tud hatolni a részecskékbe, az növeli a közvetlenül hozzáférhető szubsztrátot, és csökkenti a távolságot, amelyen keresztül a diffúziónak meg kell történnie. Ezért az optimális részecskeméret gyakran kompromisszumot jelent a tápanyagok hozzáférhetősége és az oxigén elérhetősége között .
15.3. ábra. Elektronikus pásztázó mikroszkópos kép a szilárdtest-fermentációban hordozóként használt poliamidszálon termesztett Trichoderma longibrachiatumról.
A szilárdtest-fermentációhoz számos agráripari maradék, például narancs- és citromhéj értékes mennyiségű pektint tartalmaz, amely hordozóként és induktorként szolgál. A citrusfélék héja, a gyümölcsfeldolgozó ipar fő szilárd mellékterméke, a friss gyümölcsök tömegének mintegy 50%-át teszi ki. Így a citromhéj a citromfeldolgozó ipar fő szilárd mellékterméke, amely a citrom száraz tömegének mintegy 19,8%-át teszi ki. Emiatt e maradékok ártalmatlanítása és kezelése komoly problémát jelent az iparágak számára. A héj ártalmatlanításának alternatívájaként a héj nagy mennyiségű pektinolitikus enzim előállítására használható szubsztrátként .
Ruiz és munkatársai nyolc különböző Aspergillus és Penicillium nemzetséghez tartozó gombatörzs pektináz termelését vizsgálták SSF alatt, szubsztrátként citromhéjpogácsát használva, a legjobb törzs az A. niger Aa-20 volt. Megállapították a szemcseméret kiválasztásának fontosságát, és az SSF-et egy oszlop-tálcás bioreaktorban végezték 30°C-on, 70%-os nedvességtartalom mellett, 194 ml/perc légáramlási sebességgel és citromhéjpogácsából készült szubsztrát szemcsemérettel (2-0,7 mm) 96 órán keresztül. Ilyen körülmények között 2181 U/L körüli maximális pektináz aktivitást értek el, ami azt sugallja, hogy ez az eljárás nagyon ígéretes alternatíva a pektináz előállítására.
A pektinázok termelésének szintjének növekedését figyelték meg több vizsgálatban is, amikor az agrár-ipari maradékokat további szén- és nitrogénforrásokkal egészítették ki. Patil és Dayanand például arról számolt be, hogy a citromhéj, a cirokszár és a napraforgófej szacharóz kiegészítése az A. niger DMF 27 és az A. niger DMF 45 pektináz termeléséhez SSF-ben hatékonyabb volt, mint a glükóz. Továbbá azt is észrevették, hogy a nitrogénforrások közül az ammónium-szulfát emelte a pektinázok termelési szintjét az összes szubsztrátból .
Másrészt SSF-et is végeztek hagyományos szubsztrát, például búzakorpa felhasználásával és induktorként narancshéjjal kiegészítve. Liu és munkatársai egy újonnan izolált A. niger JL-15 törzzsel javították az extracelluláris pektináz termelését, optimalizálva az SSF feltételeit válaszfelületi módszertannal. A maximális pektináz-aktivitás négyszerese volt az alapközeghez képest, mivel az optimális paraméterek 12,10% narancshéjpor, 3,20% ammónium-szulfát alkalmazása búza korpa mint szilárd szubsztrát, 51,10% nedvességtartalom és 75 órás fermentáció voltak. Hasonlóképpen Li és munkatársai megállapították, hogy a narancshéj és a búzakorpa a legjobb szubsztrát a pektináz termeléséhez, Diaz és munkatársai pedig kimutatták a szőlőmag és narancshéj keverékének pozitív hatását.
A pektináz nagyléptékű előállítására szolgáló SSF-ben működő bioreaktorokhoz kevés terv áll rendelkezésre. Kezdetben Huerta et al. 10-25 kg szárazanyag-kapacitású tömörágyas bioreaktorban végzett SSF-et A. nigerrel, szénforrásként szacharózt és citruspektint tartalmazó tápoldattal impregnált cukornádzsákot használva. Ő és Chen arról számoltak be, hogy a gázos kettős dinamikus SSF nagyobb előnyöket nyújtott a statikus SSF-hez képest az ipari enzimkészítésben, mint például a pektináz, glükoamiláz, proteáz és cellulóz, a jobb enzimaktivitás és a rövidebb fermentációs idő miatt. Ebben a 800 literes bioreaktorban a szilárd halmazállapotú közeg 90% búzakorpát, 5% rizskorpát, 2% citrusfélék héjporát és 3% kukoricalisztet tartalmazott, és a közeg különböző folyadék-szilárdság arányait (0,7, 1,0 és 1,3 (w/w)) használták. Pitol és munkatársai az A. niger pektináztermelését a tömörített ágyas bioreaktorokban végzett SSF során 12 g szárazanyagtól laboratóriumi léptékben 20-30 kg szárazanyagig kísérleti léptékben skálázták. A kapott információkból, mint például az O2-fogyasztás mértéke, a hőmérséklet és a pektináz-aktivitás eloszlása, a szerzők életképes stratégiát javasoltak a folyamat ipari szintre történő méretezéséhez.
Az extremofil enzimek (alkalofil, termostabil stb.) pektinázok használata jelentős figyelmet keltett az ipari alkalmazásokban rejlő lehetőségek miatt. Így a magas hőmérsékleten és lúgos környezetben való nagyfokú stabilitás és aktivitás kívánatos enzimtulajdonsággá vált az ipari feldolgozáshoz. Egy izolált B. subtilis törzsből SSF alatt, olcsó mezőgazdasági maradékanyagok (búzakorpa és gyapotmagpogácsa, búzakorpa és citrushulladék, búzakorpa és alfa-alfa levelek, gyapotmagpogácsa és citrushulladék, gyapotmagpogácsa és alfa-alfa levelek, citrushulladék és alfa-alfa levelek, a négy szubsztrát keveréke) kombinációinak felhasználásával magas szintű alkalofil pektinázt állítottak elő. A legjobb szinteket azonban akkor érték el, amikor búzakorpa és citrushulladék keverékét használták szubsztrátként élesztőkivonat kiegészítésével, ami összhangban van a korábban közölt korábbi vizsgálatokkal.
A termofil törzsek, mint például az izolált termofil, Thermoascus aurantiacus 179-5, amely képes volt nagy mennyiségű pektin-liázt és poligalakturonázt termelni az SSF során, amikor narancsbagaszt és búzakorpát használtak szénforrásként. Ezen enzimek optimális hőmérséklete 65°C körül volt, jó hőstabilitással, különösen a pektin-liázé, amely 60°C-on 5 órán keresztül stabil volt. Kaur és Saryanarayana megállapította, hogy a négy termofil penészgomba közül a Sporotrichum thermophile 4 napos SSF inkubáció után magas koncentrációban termelt xilanázokat, pektinázokat és cellulázokat. A kipróbált agrármaradványok kombinációi búzakorpa és citruspektin voltak 1:1 arányban. Egy másik vizsgálatban Martin és munkatársai 34 termofil és termotoleráns gombatörzset izoláltak talajból, szerves komposztból és ipari hulladékból olyan táptalajt használva, amely pektint tartalmazott egyedüli szénforrásként. Mindezek az izolált törzsek, amelyeket nemzetségszinten Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis és Thermomucor néven azonosítottak, pektinázt termeltek SSF során. Például, amikor a Thermomucor indicae seudaticae-t SSF körülmények között termesztették búzakorpa és narancs bagasse (1:1) keverékét tartalmazó táptalajon 70%-os kezdeti nedvességtartalom mellett, a poligalakturonáz maximális aktivitása 120 U/ml volt, míg SmF-ben csak 13,6 U/ml-t termelt.