Heterogene groep
2.2 Pectinases
Pectinases vormen een heterogene groep enzymen die complexe polysacchariden van plantenweefsels afbreken tot eenvoudiger moleculen zoals galacturonzuren. Hun commerciële toepassing werd voor het eerst waargenomen in 1930 voor de bereiding van wijnen en vruchtensappen. Zij hebben een aandeel van 25% in de wereldwijde verkoop van voedingsenzymen en worden industrieel gebruikt bij de extractie, klaring en concentratie van vruchtensappen, de klaring van wijnen en de extractie van oliën, aroma’s en pigmenten uit planten. Deze enzymen omvatten protopectinasen, polygalacturonasen, lyasen en pectinesterasen naar gelang van hun werkingsmechanisme. Protopectinasen katalyseren de solubilisering van protopectine. Polygalacturonasen hydrolyseren de polygalacturonzuurketen door toevoeging van water en zijn de meest voorkomende van alle pectinolytische enzymen. Lyasen katalyseren de trans-eliminatieve splitsing van het galacturonzuurpolymeer. Pectinesterases maken pectines en methanol vrij door de methylesterbindingen van de pectine ruggengraat te veresteren.
Zoals tabel 15.1 laat zien, is het gebruik van SSF voor de productie van pectinase voorgesteld met verschillende vaste agrarische en agro-industriële residuen als substraat. Schimmels van het geslacht Aspergillus zijn een van de belangrijkste bronnen van deze enzymen. Taşkin et al. onderzochten verschillende uit wijngaarden geïsoleerde Aspergillus-stammen op pectinaseproductie (polygalacturonase en polymethylgalacturonase) en zij stelden vast dat SSF beter was voor pectinaseproductie dan SmF. Evenzo bepaalden Solis-Pereira et al. dat regulatorische fenomenen, zoals inductie-repressie of activering-remming gerelateerd aan pectinase-synthese door A. niger CH4 verschillend zijn in de twee fermentatietypes, waarbij de totale productiviteit van SSF 18,8 en 4,9 keer hoger was voor endo- en exopectinase, respectievelijk, dan die in SmF. Acuña-Arguelles et al. vergeleken de eigenschappen van endo- en exopectinase en pectinelyase geproduceerd door SSF en SmF technieken van A. niger CH4. Zij stelden vast dat de kinetische en fysisch-chemische eigenschappen van deze enzymen verschillend waren naargelang het type fermentatie. Zo waren in SSF alle pectinase-activiteiten stabieler bij extreme pH- en temperatuurwaarden. Bovendien vertoonde de elektroforesestudie van de verschillende enzymextracten verkregen voor beide kweekmethodes hetzelfde aantal eiwitbanden, maar met enkele verschillen in hun elektroforetische positie, wat suggereert dat de kweekmethode verantwoordelijk zou kunnen zijn voor het induceren van veranderingen in sommige van de pectinolytische enzymen geproduceerd door A. niger.
De selectie van een geschikte drager voor het uitvoeren van SFF is essentieel, aangezien het succes van het proces ervan afhangt. SSF-substraten vereisen kenmerken met betrekking tot de chemische samenstelling van het afval (koolhydraten, stikstofbron, minerale zouten, enz.) en de fysische eigenschappen ervan voor een goede groei van de filamenteuze schimmel over het afval. Fig. 15.3 toont hoe de schimmel Trichoderma longibrachiatum groeit op het vaste substraat en het is duidelijk dat de deeltjesgrootte en de porositeit in het substraat van invloed kunnen zijn op het stromingspatroon en de verdeling van de voedingsstoffen. Kleine deeltjes, of deeltjes met grote platte oppervlakken, hebben de neiging dicht opeen te klitten, waardoor de substraatmassa moeilijk kan worden belucht. Indien het micro-organisme in het deeltje kan doordringen, verhoogt dit het direct toegankelijke substraat en vermindert de afstand waarover diffusie moet plaatsvinden. Daarom is de optimale deeltjesgrootte vaak een compromis tussen de toegankelijkheid van voedingsstoffen en de beschikbaarheid van zuurstof .
Figuur 15.3. Elektronische scan microscopie beeld van Trichoderma longibrachiatum gekweekt op polyamide vezel gebruikt als ondersteuning in solid-state fermentatie.
Voor SSF, verschillende residuen van agro-industrieën zoals sinaasappelschil en citroenschil bevatten waardevolle hoeveelheid pectine, die fungeert als ondersteuning en inducer. Schillen van citrusvruchten, het belangrijkste vaste bijproduct van de fruitverwerkende industrie, maken ongeveer 50% uit van het verse fruitgewicht. Zo is citroenschil het belangrijkste vaste bijproduct van de citroenverwerkende industrie en maakt het ongeveer 19,8% uit van het droge gewicht van de citroen. Daarom is de verwijdering en het beheer van deze residuen een ernstig probleem voor de industrie. Als alternatief voor de verwijdering van schillen kunnen ze worden gebruikt als substraat voor de productie van hoge concentraties pectinolytische enzymen.
Ruiz et al. bestudeerden de productie van pectinase door acht verschillende schimmelstammen van de genera Aspergillus en Penicillium onder SSF met als substraat citroenschilpulp, waarbij A. niger Aa-20 de beste stam was. Zij bepaalden het belang van de keuze van de deeltjesgrootte en voerden de SSF uit in een kolom-tray bioreactor bij 30°C, 70% vochtgehalte, 194 mL/min luchtdebiet, en substraatdeeltjesgrootte (2-0,7 mm) van citroenschilpulp gedurende 96 uur. Onder deze omstandigheden bereikten zij een maximale pectinase-activiteit van ongeveer 2181 U/L, wat suggereert dat dit proces een veelbelovend alternatief is voor de productie van pectinase.
In verschillende studies werd een toename van de productie van pectinases waargenomen wanneer de agro-industriële residuen werden aangevuld met extra koolstof- en stikstofbronnen. Zo meldden Patil en Dayanand dat de toevoeging van sucrose in citroenschillen, sorghumstengels en zonnebloemkoppen voor de productie van pectinase door A. niger DMF 27 en A. niger DMF 45 in SSF doeltreffender was dan glucose. Bovendien stelden zij vast dat onder de stikstofbronnen, ammoniumsulfaat het productieniveau van pectinases uit alle substraten verhoogde.
Anderzijds werd SSF ook uitgevoerd met een conventioneel substraat zoals tarwezemelen en aangevuld met sinaasappelschil als inducer. Liu et al. verbeterden de productie van extracellulaire pectinase door een nieuw geïsoleerde A. niger JL-15 stam door de condities van SSF te optimaliseren met behulp van response surface methodologie. De maximale pectinase-activiteit was vier keer zo hoog als die van het basismedium, waarbij de optimale parameters 12,10% sinaasappelschilpoeder, 3,20% ammoniumsulfaat met tarwezemelen als vast substraat, 51,10% vochtgehalte, en 75 uur fermentatie waren. Evenzo stelden Li et al. vast dat sinaasappelschillen en tarwezemelen de beste substraten waren voor de productie van pectinase en Diaz et al. toonden het positieve effect aan van het gebruik van een mengsel van druivenpulp en sinaasappelschillen.
Er zijn weinig ontwerpen beschikbaar voor bioreactoren die in SSF werken op een grootschalige productie van pectinase. Aanvankelijk voerden Huerta et al. SSF uit met A. niger in een gepakte-bed bioreactor met een capaciteit van 10 tot 25 kg droge stof, met als koolstofbron suikerrietbagasse geïmpregneerd met een voedingsoplossing die sacharose en citruspectine bevatte. Hij en Chen meldden dat gas dubbel-dynamische SSF grotere voordelen bood dan de statische SSF bij industriële enzymbereiding zoals pectinase, glucoamylase, protease, en cellulose door verbeterde enzymactiviteit en verkorte fermentatietijd. In deze bioreactor van 800 L bevatte het medium in vaste toestand 90% tarwezemelen, 5% rijstzemelen, 2% citrusschilpoeder en 3% maïsmeel, en werden verschillende vloeistof/vaste-verhoudingen van het medium (0,7, 1,0 en 1,3 (m/m)) gebruikt. Pitol et al. schalen de pectinase productie door A. niger tijdens SSF in packed-bed bioreactoren van 12 g droge stof op laboratorium schaal tot 20-30 kg droge stof op pilot schaal. Op basis van de verkregen informatie, zoals de snelheid van O2-verbruik en de verdeling van temperatuur en pectinase-activiteit, stelden de auteurs een haalbare strategie voor om het proces op te schalen naar industrieel niveau.
Het gebruik van extremofiele enzymen (alkalofiele, thermostabiele, enz.) pectinases heeft veel aandacht getrokken vanwege het potentieel voor industriële toepassingen. Zo zijn een hoge stabiliteit en activiteit bij hoge temperatuur en in een alkalisch milieu wenselijke enzymeigenschappen geworden voor industriële verwerking. Een hoog niveau van alkalofiele pectinase werd geproduceerd door een geïsoleerde stam van B. subtilis onder SSF met combinaties van goedkope landbouwresiduen (tarwezemelen en katoenzaadkoek, tarwezemelen en citrusvruchtenafval, tarwezemelen en alfa-alfabladeren, katoenzaadkoek en citrusvruchtenafval, katoenzaadkoek en alfa-alfabladeren, citrusvruchtenafval en alfa-alfabladeren, een mengsel van de vier substraten) . De beste niveaus werden echter verkregen wanneer een mengsel van tarwezemelen en citrusafval met een supplement van gistextract als substraat werd gebruikt, wat in overeenstemming is met de eerder gerapporteerde studies.
Thermostabiele enzymen kunnen worden geproduceerd door thermofiele stammen zoals de geïsoleerde thermofiel, Thermoascus aurantiacus 179-5, die in staat was hoge niveaus pectinelyase en polygalacturonase te produceren tijdens de SSF met sinaasappelbagasse en tarwezemelen als koolstofbronnen. Deze enzymen vertoonden een optimale temperatuur rond 65°C met een goede thermostabiliteit, vooral pectinelyase, dat gedurende 5 uur stabiel was bij 60°C. Kaur en Saryanarayana ontdekten dat van de vier thermofiele schimmels, Sporotrichum thermophile een hoge concentratie xylanases, pectinases en cellulases produceerde na 4 dagen incubatie in SSF. De combinaties van agro-residu’s die werden uitgeprobeerd waren tarwezemelen en citruspectine in een verhouding van 1:1. In een andere studie isoleerden Martin et al. 34 thermofiele en thermotolerante schimmelstammen uit grond, organische compost en industrieel afval met behulp van een kweekmedium dat pectine als enige koolstofbron bevatte. Al deze geïsoleerde stammen, die op genusniveau werden geïdentificeerd als Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis, en Thermomucor, produceerden pectinase tijdens SSF. Wanneer Thermomucor indicae seudaticae bijvoorbeeld onder SSF-condities werd gekweekt op een medium dat een mengsel van tarwezemelen en sinaasappelbagasse (1:1) bij 70% van het oorspronkelijke vochtgehalte bevatte, bedroeg de maximale activiteit van polygalacturonase 120 U/mL, terwijl het in SmF slechts 13,6 U/mL produceerde.