Heterogene Gruppe
2.2 Pektinasen
Pektinasen bilden eine heterogene Gruppe von Enzymen, die komplexe Polysaccharide pflanzlicher Gewebe in einfachere Moleküle wie Galakturonsäuren zerlegen. Ihre kommerzielle Anwendung wurde erstmals 1930 bei der Herstellung von Weinen und Fruchtsäften beobachtet. Sie haben einen Anteil von 25 % am weltweiten Umsatz mit Lebensmittelenzymen und werden industriell zur Extraktion, Klärung und Konzentration von Fruchtsäften, zur Klärung von Wein und zur Extraktion von Ölen, Aromen und Pigmenten aus Pflanzen eingesetzt. Diese Enzyme werden je nach ihrer Wirkungsweise in Protopektinasen, Polygalakturonasen, Lyasen und Pektinesterasen unterteilt. Protopektinasen katalysieren die Solubilisierung von Protopektin. Polygalacturonasen hydrolysieren die Polygalacturonsäurekette durch Zugabe von Wasser und sind die am häufigsten vorkommenden pektinolytischen Enzyme. Lyasen katalysieren die trans-eliminative Spaltung des Galakturonsäurepolymers. Pektinesterasen setzen Pektine und Methanol frei, indem sie die Methylesterbindungen des Pektingerüsts entestern.
Wie in Tabelle 15.1 dargestellt, wurde die Verwendung von VNS für die Pektinaseproduktion unter Verwendung verschiedener fester landwirtschaftlicher und agroindustrieller Rückstände als Substrate vorgeschlagen. Pilze der Gattung Aspergillus sind eine der wichtigsten Quellen für diese Enzyme. Taşkin et al. untersuchten mehrere aus Weinbergen isolierte Aspergillus-Stämme auf ihre Pektinase-Produktion (Polygalacturonase und Polymethylgalacturonase) und stellten fest, dass SSF für die Pektinase-Produktion besser geeignet war als SmF. In ähnlicher Weise stellten Solis-Pereira et al. fest, dass regulatorische Phänomene wie Induktion-Reduktion oder Aktivierung-Hemmung im Zusammenhang mit der Pektinase-Synthese durch A. niger CH4 in den beiden Fermentationsarten unterschiedlich sind, wobei die Gesamtproduktivität von SSF für Endo- und Exopectinase 18,8- bzw. 4,9-mal höher war als in SmF. Darüber hinaus verglichen Acuña-Arguelles et al. die Eigenschaften von Endo- und Exopectinase und Pektinlyase, die mit SSF- und SmF-Techniken aus A. niger CH4 hergestellt wurden. Sie stellten fest, dass die kinetischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Enzyme je nach Art der Fermentation unterschiedlich waren. So waren in SSF alle Pektinaseaktivitäten bei extremen pH- und Temperaturwerten stabiler. Darüber hinaus zeigte die Elektrophorese-Studie der verschiedenen Enzymextrakte, die für beide Kulturmethoden erhalten wurden, die gleiche Anzahl an Proteinbanden, aber mit einigen Unterschieden in ihrer elektrophoretischen Position, was darauf hindeutet, dass die Kulturmethode für die Induzierung von Veränderungen in einigen der von A. niger produzierten pektinolytischen Enzyme verantwortlich sein kann.
Die Auswahl eines geeigneten Trägers für die Durchführung der SSF ist von wesentlicher Bedeutung, da der Erfolg des Prozesses davon abhängt. SSF-Substrate erfordern Merkmale in Bezug auf die chemische Zusammensetzung des Abfalls (Kohlenhydrate, Stickstoffquelle, Mineralsalze usw.) und seine physikalischen Eigenschaften für ein gutes Wachstum des Fadenpilzes auf dem Abfall. Abb. 15.3 zeigt, wie der Pilz Trichoderma longibrachiatum auf dem festen Substrat wächst, und es ist offensichtlich, dass die Partikelgröße und die Porosität des Substrats das Strömungsmuster und die Nährstoffverteilung beeinflussen können. Kleine Partikel oder Partikel mit großen flachen Oberflächen neigen dazu, sich eng zusammenzudrängen, was die Belüftung der Substratmasse erschwert. Wenn der Mikroorganismus in die Partikel eindringen kann, vergrößert sich das direkt zugängliche Substrat und die Distanz, über die die Diffusion erfolgen muss, verringert sich. Daher stellt die optimale Partikelgröße oft einen Kompromiss zwischen der Zugänglichkeit von Nährstoffen und der Verfügbarkeit von Sauerstoff dar.
Abbildung 15.3. Elektronenmikroskopische Aufnahme von Trichoderma longibrachiatum, gewachsen auf Polyamidfasern, die als Träger in der Festphasenfermentation verwendet werden.
Für die SSF enthalten verschiedene Rückstände der Agrarindustrie wie Orangen- und Zitronenschalen wertvolle Mengen an Pektin, das als Träger und Induktor dient. Zitrusschalen, das wichtigste feste Nebenprodukt der obstverarbeitenden Industrie, machen etwa 50 % des Gewichts der frischen Früchte aus. So sind Zitronenschalen das wichtigste feste Nebenprodukt der Zitronenverarbeitungsindustrie und machen etwa 19,8 % der Trockenmasse der Zitrone aus. Aus diesem Grund wird die Entsorgung und Bewirtschaftung dieser Rückstände zu einem ernsten Problem für die Industrie. Als Alternative zur Entsorgung der Schalen können diese als Substrat für die Produktion hoher Mengen pektinolytischer Enzyme verwendet werden.
Ruiz et al. untersuchten die Produktion von Pektinase durch acht verschiedene Pilzstämme aus den Gattungen Aspergillus und Penicillium unter SSF unter Verwendung von Zitronenschalentrester als Substrat, wobei A. niger Aa-20 der beste Stamm war. Sie ermittelten die Bedeutung der Auswahl der Partikelgröße und führten die SSF in einem Säulen-Bioreaktor bei 30 °C, 70 % Feuchtigkeitsgehalt, 194 ml/min Luftdurchsatz und einer Substratpartikelgröße (2-0,7 mm) von Zitronenschalentrester für 96 Stunden durch. Unter diesen Bedingungen erreichten sie eine maximale Pektinaseaktivität von etwa 2181 U/L, was diesen Prozess als eine vielversprechende Alternative für die Pektinaseproduktion nahelegt.
In mehreren Studien wurde eine Steigerung der Pektinaseproduktion festgestellt, wenn die agroindustriellen Rückstände mit zusätzlichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen ergänzt wurden. So berichteten Patil und Dayanand, dass die Zugabe von Saccharose in Zitronenschalen, Sorghumstängeln und Sonnenblumenköpfen für die Produktion von Pektinase durch A. niger DMF 27 und A. niger DMF 45 in SSF effektiver war als Glucose. Außerdem stellten sie fest, dass unter den Stickstoffquellen Ammoniumsulfat die Produktion von Pektinasen aus allen Substraten erhöhte.
Andererseits wurde die SSF auch mit einem herkömmlichen Substrat wie Weizenkleie durchgeführt und mit Orangenschalen als Induktor ergänzt. Liu et al. verbesserten die Produktion von extrazellulärer Pektinase durch einen neu isolierten A. niger JL-15-Stamm, indem sie die SSF-Bedingungen durch Response Surface Methodology optimierten. Die maximale Pektinaseaktivität war viermal so hoch wie die des Basismediums, wobei die optimalen Parameter 12,10 % Orangenschalenpulver, 3,20 % Ammoniumsulfat unter Verwendung von Weizenkleie als festes Substrat, 51,10 % Feuchtigkeitsgehalt und 75 Stunden Fermentation waren. In ähnlicher Weise stellten Li et al. fest, dass Orangenschalen und Weizenkleie die besten Substrate für die Pektinaseproduktion sind, und Diaz et al. wiesen die positive Wirkung einer Mischung aus Traubentrester und Orangenschalen nach.
Es gibt nur wenige Entwürfe für Bioreaktoren, die in SSF für die Produktion von Pektinase in großem Maßstab eingesetzt werden. Zunächst führten Huerta et al. SSF mit A. niger in einem Festbett-Bioreaktor mit einer Kapazität von 10 bis 25 kg Trockenmasse durch, wobei als Kohlenstoffquellen Zuckerrohrbagasse verwendet wurde, die mit einer Nährlösung imprägniert war, die Saccharose und Citruspektin enthielt. Er und Chen berichteten, dass die doppelt-dynamische SSF bei der Herstellung industrieller Enzyme wie Pektinase, Glucoamylase, Protease und Cellulose aufgrund der verbesserten Enzymaktivitäten und der verkürzten Fermentationszeit größere Vorteile als die statische SSF bietet. In diesem 800-Liter-Bioreaktor bestand das Feststoffmedium zu 90 % aus Weizenkleie, zu 5 % aus Reiskleie, zu 2 % aus Zitrusschalenpulver und zu 3 % aus Maismehl, und es wurden verschiedene Flüssigkeits-Feststoff-Verhältnisse des Mediums (0,7, 1,0 und 1,3 (w/w)) verwendet. Pitol et al. skalierten die Pektinaseproduktion durch A. niger während der SSF in Festbett-Bioreaktoren von 12 g Trockenmasse im Labormaßstab auf 20-30 kg Trockenmasse im Pilotmaßstab. Anhand der gewonnenen Informationen, wie z. B. der O2-Verbrauchsrate und der Verteilung von Temperatur und Pektinaseaktivität, schlugen die Autoren eine praktikable Strategie für die Skalierung des Prozesses auf industrielles Niveau vor.
Die Verwendung von extremophilen Enzymen (alkalophile, thermostabile usw.) hat aufgrund ihres Potenzials für industrielle Anwendungen große Aufmerksamkeit erregt. So sind hohe Stabilität und Aktivität bei hohen Temperaturen und in alkalischer Umgebung zu wünschenswerten Enzymeigenschaften für die industrielle Verarbeitung geworden. Aus einem isolierten Stamm von B. subtilis wurde unter Verwendung von Kombinationen billiger landwirtschaftlicher Rückstände (Weizenkleie und Baumwollkuchen, Weizenkleie und Zitrusfruchtabfälle, Weizenkleie und Alpha-Alpha-Blätter, Baumwollkuchen und Zitrusfruchtabfälle, Baumwollkuchen und Alpha-Alpha-Blätter, Zitrusfruchtabfälle und Alpha-Alpha-Blätter, eine Mischung aus den vier Substraten) unter SSF ein hoher Gehalt an alkalophiler Pektinase hergestellt. Die besten Werte wurden jedoch erzielt, wenn eine Mischung aus Weizenkleie und Zitrusabfällen mit einem Zusatz von Hefeextrakt als Substrat verwendet wurde, was mit den früher berichteten Studien übereinstimmt.
Thermostabile Enzyme können von thermophilen Stämmen wie dem isolierten Thermophilen Thermoascus aurantiacus 179-5 produziert werden, der in der Lage war, während der SSF unter Verwendung von Orangenbagasse und Weizenkleie als Kohlenstoffquellen hohe Mengen an Pektinlyase und Polygalacturonase zu produzieren. Diese Enzyme wiesen ein Temperaturoptimum um 65 °C auf und waren gut thermostabil, insbesondere die Pektinlyase, die 5 Stunden lang bei 60 °C stabil war. Kaur und Saryanarayana stellten fest, dass von den vier thermophilen Schimmelpilzen Sporotrichum thermophile nach 4 Tagen Inkubation in SSF eine hohe Konzentration an Xylanasen, Pektinasen und Cellulasen produzierte. Bei den untersuchten Kombinationen von Agro-Rückständen handelte es sich um Weizenkleie und Citruspektin im Verhältnis 1:1. In einer anderen Studie isolierten Martin et al. 34 thermophile und thermotolerante Pilzstämme aus Erde, organischem Kompost und Industrieabfällen unter Verwendung eines Kulturmediums, das Pektin als einzige Kohlenstoffquelle enthielt. Alle diese isolierten Stämme, die auf Gattungsebene als Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis und Thermomucor identifiziert wurden, produzierten während der SSF Pektinase. Als beispielsweise Thermomucor indicae seudaticae unter SSF-Bedingungen auf Medien kultiviert wurde, die eine Mischung aus Weizenkleie und Orangenbagasse (1:1) bei 70 % der ursprünglichen Feuchtigkeit enthielten, betrug die maximale Aktivität der Polygalacturonase 120 U/mL, während sie in SmF nur 13,6 U/mL produzierte.