Grupa heterogeniczna
2.2 Pektynazy
Pektynazy stanowią heterogeniczną grupę enzymów, które rozkładają złożone polisacharydy tkanek roślinnych na prostsze cząsteczki, takie jak kwasy galakturonowe. Ich komercyjne zastosowanie zaobserwowano po raz pierwszy w 1930 roku do przygotowania win i soków owocowych. Mają one udział 25% w globalnej sprzedaży enzymów spożywczych i są przemysłowo wykorzystywane do ekstrakcji, klarowania i zagęszczania soków owocowych, klarowania win oraz ekstrakcji olejów, aromatów i pigmentów z roślin. Enzymy te obejmują protopektynazy, poligalakturonazy, liazy i pektynoesterazy na podstawie ich sposobu działania. Protopektynazy katalizują rozpuszczanie protopektyny. Poligalakturonazy hydrolizują łańcuch kwasu poligalakturonowego przez dodanie wody i są najbardziej rozpowszechnione wśród wszystkich enzymów pektynolitycznych. Liazy katalizują transeliminacyjne rozszczepienie polimeru kwasu galakturonowego. Pektynaesterazy uwalniają pektyny i metanol poprzez deestryfikację wiązań estrów metylowych szkieletu pektyny .
Jak przedstawiono w tabeli 15.1, zaproponowano wykorzystanie SSF do produkcji pektynazy, stosując jako substraty różne stałe pozostałości rolnicze i rolno-przemysłowe. Grzyby z rodzaju Aspergillus są jednym z najważniejszych źródeł tych enzymów. Taşkin i wsp. badali kilka szczepów Aspergillus wyizolowanych z winnic pod kątem produkcji pektynazy (poligalakturonazy i polimetylogalakturonazy) i stwierdzili, że SSF jest lepsza niż SmF do produkcji pektynazy. Podobnie Solis-Pereira i wsp. ustalili, że zjawiska regulacyjne, takie jak indukcja-represja lub aktywacja-inhibicja związane z syntezą pektynazy przez A. niger CH4 są różne w obu typach fermentacji, osiągając całkowitą produktywność SSF, która była 18,8 i 4,9 razy wyższa dla endo- i egzopektynazy, odpowiednio, niż w SmF. Dodatkowo, Acuña-Arguelles i wsp. porównali właściwości endo- i egzopektynazy oraz liazy pektynowej wytwarzanych techniką SSF i SmF z A. niger CH4. Zaobserwowali, że właściwości kinetyczne i fizykochemiczne tych enzymów były różne w zależności od rodzaju fermentacji. I tak, w SSF wszystkie aktywności pektynazy były bardziej stabilne w skrajnych wartościach pH i temperatury. Dodatkowo, badanie elektroforetyczne różnych ekstraktów enzymatycznych uzyskanych dla obu metod hodowli wykazało tę samą liczbę pasm białkowych, ale z pewnymi różnicami w ich położeniu elektroforetycznym, co sugeruje, że metoda hodowli może być odpowiedzialna za indukowanie zmian w niektórych enzymach pektynolitycznych produkowanych przez A. niger.
Dobór odpowiedniego podłoża do przeprowadzenia SFF jest bardzo istotny, ponieważ od tego zależy powodzenie procesu. Podłoża SSF wymagają cech w odniesieniu do składu chemicznego odpadów (węglowodany, źródło azotu, sole mineralne, itp.) oraz ich właściwości fizycznych dla dobrego wzrostu grzybów strzępkowych nad odpadami. Rys. 15.3 pokazuje jak grzyb Trichoderma longibrachiatum rośnie na stałym podłożu i jest oczywiste, że wielkość cząstek i porowatość podłoża może wpływać na wzór przepływu i dystrybucję składników odżywczych. Małe cząsteczki lub cząsteczki o dużych płaskich powierzchniach mają tendencję do ścisłego upakowania się razem, co utrudnia napowietrzanie masy substratu. Jeśli mikroorganizm może wniknąć do wnętrza cząstki, zwiększa to ilość bezpośrednio dostępnego substratu i zmniejsza odległość, na jaką musi zachodzić dyfuzja. Dlatego optymalny rozmiar cząstki często stanowi kompromis pomiędzy dostępnością składników odżywczych a dostępnością tlenu .
Ryc. 15.3. Obraz mikroskopu elektronowego Trichoderma longibrachiatum hodowanej na włóknie poliamidowym stosowanym jako podłoże w fermentacji w stanie stałym.
Dla SSF, kilka pozostałości przemysłu rolniczego, takich jak skórka pomarańczy i skórka cytryny zawierają cenne ilości pektyn, które działają jako podłoże i induktor. Skórka cytrusów, główny stały produkt uboczny przemysłu przetwórstwa owocowego, stanowi około 50% wagi świeżych owoców. Tak więc, skórka cytryny jest głównym stałym produktem ubocznym powstającym w przemyśle przetwórstwa cytryn i stanowi około 19,8% suchej masy cytryny. Z tego powodu, utylizacja i zarządzanie tymi pozostałościami staje się poważnym problemem dla przemysłu. Alternatywą dla usuwania skórek jest wykorzystanie ich jako substratu do produkcji wysokich poziomów enzymów pektynolitycznych. Ruiz i wsp. badali produkcję pektynazy przez osiem różnych szczepów grzybów z rodzajów Aspergillus i Penicillium w warunkach SSF, używając jako substratu wytłoków ze skórek cytrynowych, przy czym najlepszym szczepem okazał się A. niger Aa-20. Określili oni znaczenie wyboru wielkości cząstek i przeprowadzili SSF w bioreaktorze kolumnowym w temperaturze 30°C, przy wilgotności 70%, przepływie powietrza 194 mL/min i wielkości cząstek substratu (2-0,7 mm) z wytłoków ze skórki cytryny przez 96 h. W tych warunkach osiągnęli maksymalną wielkość skórek. W tych warunkach osiągnięto maksymalną aktywność pektynazy około 2181 U/L, co sugeruje ten proces jako bardzo obiecującą alternatywę dla produkcji pektynazy.
W kilku badaniach zauważono wzrost poziomu produkcji pektynaz, gdy pozostałości rolno-przemysłowe zostały uzupełnione o dodatkowe źródła węgla i azotu. Na przykład, Patil i Dayanand podali, że dodatek sacharozy w skórce cytryny, łodydze sorgo i główce słonecznika do produkcji pektynazy przez A. niger DMF 27 i A. niger DMF 45 w SSF był bardziej efektywny niż glukoza. Ponadto zauważyli, że spośród źródeł azotu, siarczan amonu podniósł poziom produkcji pektynaz ze wszystkich substratów .
Z drugiej strony, SSF przeprowadzono również przy użyciu konwencjonalnego substratu, takiego jak otręby pszenne i uzupełnionego skórką pomarańczową jako induktorem. Liu i wsp. poprawili produkcję zewnątrzkomórkowej pektynazy przez nowo wyizolowany szczep A. niger JL-15 optymalizując warunki SSF za pomocą metodologii powierzchni odpowiedzi. Maksymalna aktywność pektynazy była czterokrotnie wyższa niż w podłożu podstawowym przy optymalnych parametrach: 12,10% sproszkowanej skórki pomarańczowej, 3,20% siarczanu amonu z wykorzystaniem otrąb pszennych jako stałego substratu, 51,10% wilgotności i 75 h fermentacji. Podobnie Li i wsp. określili, że skórki pomarańczowe i otręby pszenne są najlepszymi substratami do produkcji pektynazy, a Diaz i wsp. wykazali pozytywny efekt zastosowania mieszaniny wytłoków z winogron i skórek pomarańczowych.
Dostępnych jest niewiele konstrukcji bioreaktorów pracujących w SSF do produkcji pektynazy na dużą skalę. Początkowo Huerta i wsp. prowadzili SSF z A. niger w bioreaktorze z pakowanym dnem o pojemności od 10 do 25 kg suchej masy, używając jako źródła węgla wytłoków z trzciny cukrowej impregnowanych pożywką zawierającą sacharozę i pektynę cytrusową. He i Chen donoszą, że gazowa podwójnie dynamiczna SSF oferuje większe korzyści niż statyczna SSF w przemysłowym przygotowywaniu enzymów, takich jak pektynaza, glukoamylaza, proteaza i celuloza, ze względu na lepszą aktywność enzymów i krótszy czas fermentacji. W tym bioreaktorze o pojemności 800 L, medium w stanie stałym zawierało 90% otrębów pszennych, 5% otrębów ryżowych, 2% sproszkowanych skórek cytrusowych i 3% mąki kukurydzianej, przy czym zastosowano różne proporcje ciecz-ciało stałe medium (0.7, 1.0, i 1.3 (w/w)). Pitol i wsp. wyskalowali produkcję pektynazy przez A. niger podczas SSF w bioreaktorach typu packed-bed z 12 g suchej masy w skali laboratoryjnej do 20-30 kg suchej masy w skali pilotowej. Na podstawie uzyskanych informacji, takich jak tempo zużycia O2 oraz rozkład temperatury i aktywności pektynazy, autorzy zaproponowali realną strategię skalowania procesu do poziomu przemysłowego.
Użycie ekstremofilnych enzymów (alkalofilnych, termostabilnych, itp.) pektynaz przyciągnęło znaczną uwagę ze względu na ich potencjał do zastosowań przemysłowych. Dlatego też wysoka stabilność i aktywność w wysokiej temperaturze i środowisku alkalicznym stały się pożądanymi właściwościami enzymów w przetwórstwie przemysłowym. Wysoki poziom alkalofilnej pektynazy został wyprodukowany z wyizolowanego szczepu B. subtilis w warunkach SSF przy użyciu kombinacji tanich pozostałości rolniczych (otręby pszenne i makuch bawełniany, otręby pszenne i odpady cytrusowe, otręby pszenne i liście alfa-alfa, makuch bawełniany i odpady cytrusowe, makuch bawełniany i liście alfa-alfa, odpady cytrusowe i liście alfa-alfa, mieszanina czterech substratów). Jednak najlepsze poziomy uzyskano, gdy jako substratu użyto mieszaniny otrębów pszennych i odpadów cytrusowych z dodatkiem ekstraktu drożdżowego, co jest zgodne z wynikami wcześniejszych badań.
Thermostabilne enzymy mogą być wytwarzane przez szczepy termofilne, takie jak wyizolowany termofil, Thermoascus aurantiacus 179-5, który był w stanie wytworzyć wysoki poziom liazy pektynowej i poligalakturonazy podczas SSF z wykorzystaniem wytłoków z pomarańczy i otrębów pszennych jako źródeł węgla. Enzymy te wykazywały optimum temperaturowe około 65°C z dobrą termostabilnością, szczególnie liazę pektynową, która była stabilna przez 5 h w 60°C. Kaur i Saryanarayana stwierdzili, że spośród czterech termofilnych pleśni, Sporotrichum thermophile wytwarza wysokie stężenie ksylanaz, pektynaz i celulaz po 4 dniach inkubacji w SSF. Kombinacje badanych agropozostałości obejmowały otręby pszenne i pektynę cytrusową w stosunku 1:1. W innym badaniu Martin i wsp. wyizolowali 34 termofilne i termotolerancyjne szczepy grzybów z gleby, kompostu organicznego i odpadów przemysłowych, stosując podłoże hodowlane zawierające pektynę jako jedyne źródło węgla. Wszystkie wyizolowane szczepy, które zidentyfikowano na poziomie rodzajowym jako Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis i Thermomucor, wytwarzały pektynazy podczas SSF. Na przykład, gdy Thermomucor indicae seudaticae był hodowany w warunkach SSF na podłożu zawierającym mieszaninę otrębów pszennych i wytłoków z pomarańczy (1:1) o wilgotności początkowej 70%, maksymalna aktywność poligalakturonazy wynosiła 120 U/mL, podczas gdy w SmF produkował tylko 13,6 U/mL.