Heterogene gruppe
2.2 Pektinaser
Pektinaser udgør en heterogen gruppe af enzymer, der nedbryder komplekse polysaccharider i plantevæv til enklere molekyler som galacturonsyrer. Deres kommercielle anvendelse blev først observeret i 1930 til fremstilling af vin og frugtsaft . De har en andel på 25 % af det globale salg af fødevareenzymer, og de anvendes industrielt til ekstraktion, klaring og koncentration af frugtsaft, klaring af vin og ekstraktion af olier, aromaer og pigmenter fra planter . Disse enzymer omfatter protopektinaser, polygalacturonaser, lyaser og pektinesteraser på grundlag af deres virkemåde. Protopektinaser katalyserer solubiliseringen af protopektin. Polygalacturonaser hydrolyserer polygalacturonsyrekæden ved tilsætning af vand og er de hyppigst forekommende blandt alle de pektinolytiske enzymer. Lyaser katalyserer den trans-eliminative spaltning af galacturonsyrepolymeren. Pektinesteraser frigør pektiner og methanol ved at af-esterificere methylesterbindingerne i pektinryggen.
Som det fremgår af tabel 15.1, er det blevet foreslået at anvende SSF til produktion af pektinaser ved hjælp af forskellige faste landbrugs- og agroindustrielle restprodukter som substrater . Svampe fra slægten Aspergillus er en af de vigtigste kilder til disse enzymer. Taşkin et al. screenede flere Aspergillus-stammer isoleret fra vinmarker for produktion af pektinase (polygalacturonase og polymethylgalacturonase), og de fastslog, at SSF var bedre end SmF til produktion af pektinase. På samme måde fastslog Solis-Pereira et al., at reguleringsfænomener som f.eks. induktion-repression eller aktivering-hæmning i forbindelse med pektinasesyntese af A. niger CH4 er forskellige i de to fermenteringstyper, idet de nåede frem til en samlet produktivitet i SSF, der var 18,8 og 4,9 gange højere for henholdsvis endo- og exopektinase end i SmF. Acuña-Arguelles et al. sammenlignede desuden egenskaberne af endo- og exopectinase og pektinlyase produceret ved SSF- og SmF-teknikker fra A. niger CH4. De observerede, at de kinetiske og fysisk-kemiske egenskaber af disse enzymer var forskellige afhængigt af fermenteringstypen. I SSF var alle pektinaseaktiviteterne således mere stabile ved ekstreme pH- og temperaturværdier. Desuden viste elektroforeseundersøgelsen af de forskellige enzymatiske ekstrakter opnået for begge dyrkningsmetoder det samme antal proteinbånd, men med nogle forskelle i deres elektroforetiske position, hvilket tyder på, at dyrkningsmetoden kan være ansvarlig for at inducere ændringer i nogle af de pektinolytiske enzymer produceret af A. niger.
Det er vigtigt at vælge en passende støtte til udførelse af SFF, da processens succes afhænger af den. SSF-substrater kræver egenskaber i forhold til affaldets kemiske sammensætning (kulhydrater, kvælstofkilde, mineralsalte osv.) og dets fysiske egenskaber for at sikre en god vækst af filamentøs svamp over affaldet. Fig. 15.3 viser, hvordan svampen Trichoderma longibrachiatum vokser på det faste substrat, og det er tydeligt, at partikelstørrelsen og porøsiteten i substratet kan påvirke strømningsmønsteret og næringsstoffordelingen. Små partikler eller partikler med store flade overflader har en tendens til at pakke tæt sammen, hvilket gør det vanskeligt at lufte substratmassen. Hvis mikroorganismen kan trænge ind i partiklen, øges den direkte tilgængelige substratmængde, og den afstand, som diffusionen skal foregå over, mindskes. Derfor er den optimale partikelstørrelse ofte et kompromis mellem tilgængeligheden af næringsstoffer og tilgængeligheden af ilt .
Figur 15.3. Elektronisk scanningsmikroskopibillede af Trichoderma longibrachiatum dyrket på polyamidfibre, der anvendes som støtte i faststoffermentering.
Til SSF indeholder flere restprodukter fra agroindustrier såsom appelsinskal og citronskal værdifulde mængder pektin, der fungerer som støtte og inducerende faktor. Citrusskaller, det vigtigste faste biprodukt fra frugtforarbejdningsindustrien, udgør ca. 50 % af den friske frugtvægt. Citronskal er således det vigtigste faste biprodukt fra citronforarbejdningsindustrien og udgør ca. 19,8 % af tørmassen af citroner . Derfor bliver bortskaffelse og forvaltning af disse restprodukter et alvorligt problem for industrien. Som et alternativ til bortskaffelse af skaller kan de anvendes som substrat til produktion af høje niveauer af pektinolytiske enzymer.
Ruiz et al. undersøgte produktionen af pektinase af otte forskellige svampestammer fra slægterne Aspergillus og Penicillium under SSF med anvendelse af citronskalrester som substrat, hvor A. niger Aa-20 var den bedste stamme. De fastslog betydningen af valget af partikelstørrelse og udførte SSF i en kolonne-bioreaktor ved 30 °C, 70 % vandindhold, 194 mL/min luftstrømningshastighed og en substratpartikelstørrelse (2-0,7 mm) af citronskalrester i 96 timer. Under disse betingelser nåede de en maksimal pektinaseaktivitet på omkring 2181 U/L, hvilket tyder på, at denne proces er et meget lovende alternativ til produktion af pektinase.
I flere undersøgelser blev der bemærket en stigning i niveauet i produktionen af pektinaser, når de agroindustrielle restprodukter blev suppleret med yderligere kulstof- og kvælstofkilder. For eksempel rapporterede Patil og Dayanand, at supplementering af saccharose i citronskal, sorghumstængler og solsikkehoved til produktion af pektinase af A. niger DMF 27 og A. niger DMF 45 i SSF var mere effektiv end glukose. Desuden bemærkede de også, at blandt kvælstofkilderne hævede ammoniumsulfat produktionsniveauet af pektinaser fra alle substraterne .
På den anden side blev SSF også udført ved hjælp af et konventionelt substrat såsom hvedeklid og suppleret med appelsinskal som inducer. Liu et al. forbedrede produktionen af ekstracellulær pektinase af en nyligt isoleret A. niger JL-15-stamme ved at optimere betingelserne for SSF ved hjælp af responsflademetodologi. Den maksimale pektinaseaktivitet var fire gange så høj som i basismediet, idet de optimale parametre var 12,10 % appelsinskalpulver, 3,20 % ammoniumsulfat med anvendelse af hvedeklid som fast substrat, 51,10 % vandindhold og 75 timers fermentering. Ligeledes fastslog Li et al., at appelsinskal og hvedeklid var de bedste substrater til produktion af pektinase, og Diaz et al. påviste den positive effekt af at anvende en blanding af druetærte og appelsinskal.
Der findes kun få design til bioreaktorer, der fungerer i SSF til produktion af pektinase i stor skala. I første omgang udførte Huerta et al. SSF med A. niger i en bioreaktor med et pakket bed med en kapacitet fra 10 til 25 kg tørstof ved hjælp af sukkerrørsbagasse som kulstofkilder, der var imprægneret med en næringsopløsning, der indeholdt saccharose og citruspectin. Han og Chen rapporterede, at gasdobbelt dynamisk SSF gav større fordele end statisk SSF i forbindelse med industriel enzymfremstilling som f.eks. pektinase, glucoamylase, protease og cellulose på grund af forbedrede enzymaktiviteter og kortere fermenteringstid. I denne bioreaktor på 800 L indeholdt faststofmediet 90 % hvedeklid, 5 % risklid, 2 % citrusskalpulver og 3 % majsmel, og der blev anvendt forskellige væske/faststof-forhold i mediet (0,7, 1,0 og 1,3 (w/w)). Pitol et al. har opskaleret pektinaseproduktionen af A. niger under SSF i bioreaktorer med pakket seng fra 12 g tørstof i laboratorieskala til 20-30 kg tørstof i pilotskala. Ud fra de opnåede oplysninger, såsom forbruget af O2 og fordelingen af temperatur og pektinaseaktivitet, foreslog forfatterne en levedygtig strategi for opskalering af processen til industrielt niveau.
Anvendelsen af ekstremofile enzymer (alkalofile, termostabile osv.) pektinaser har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed på grund af potentialet for industrielle anvendelser. Således er høj stabilitet og aktivitet ved høj temperatur og alkalisk miljø blevet ønskelige enzymegenskaber til industriel forarbejdning. Der blev produceret en høj grad af alkalofil pektinase fra en isoleret stamme af B. subtilis under SSF ved hjælp af kombinationer af billige landbrugsrester (hvedeklid og bomuldsfrøkage, hvedeklid og citrusaffald, hvedeklid og alpha-alpha-blade, bomuldsfrøkage og citrusaffald, bomuldsfrøkage og alpha-alpha-blade, citrusaffald og alpha-alpha-blade, en blanding af de fire substrater) . De bedste niveauer blev dog opnået, når en blanding af hvedeklid og citrusaffald med et supplement af gærekstrakt blev anvendt som substrat, hvilket er i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser, der er rapporteret tidligere.
Thermostabile enzymer kan produceres af termofile stammer som f.eks. den isolerede termofile, Thermoascus aurantiacus 179-5, som var i stand til at producere høje niveauer af pektinlyase og polygalacturonase under SSF ved brug af appelsinbagasse og hvedeklid som kulstofkilder. Disse enzymer havde en optimal temperatur omkring 65 °C med god termostabilitet, især pektinlyase, som var stabil i 5 timer ved 60 °C . Kaur og Saryanarayana fandt, at blandt fire termofile skimmelsvampe producerede Sporotrichum thermophile en høj koncentration af xylanaser, pektinaser og cellulaser efter 4 dages inkubation i SSF. De afprøvede kombinationer af landbrugsresidualer var hvedeklid og citruspectin i forholdet 1:1. I en anden undersøgelse isolerede Martin et al. 34 termofile og termotolerante svampestammer fra jord, organisk kompost og industriaffald ved hjælp af et kulturmedium, der indeholdt pektin som den eneste kulstofkilde. Alle disse isolerede stammer, som blev identificeret på slægtsniveau som Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis og Thermomucor, producerede pektinase under SSF. For eksempel, da Thermomucor indicae seudaticae blev dyrket under SSF-betingelser på medier indeholdende en blanding af hvedeklid og appelsinbagasse (1:1) ved 70 % af den oprindelige fugtighed, var den maksimale aktivitet af polygalacturonase 120 U/mL, mens den i SmF kun producerede 13,6 U/mL.