Grupa eterogenă
2.2 Pectinazele
Pectinazele constituie un grup eterogen de enzime care descompun polizaharidele complexe din țesuturile vegetale în molecule mai simple, cum ar fi acizii galacturonici. Aplicarea lor comercială a fost observată pentru prima dată în 1930 pentru prepararea vinurilor și sucurilor de fructe . Acestea dețin o cotă de 25% din vânzările globale de enzime alimentare și sunt utilizate la nivel industrial în extracția, clarificarea și concentrarea sucurilor de fructe, în clarificarea vinurilor și în extracția uleiurilor, aromelor și pigmenților din plante . Aceste enzime includ protopectinazele, poligalacturonazele, lipazele și pectinazele în funcție de modul lor de acțiune. Protopectinazele catalizează solubilizarea protopectinei. Poligalacturonazele hidrolizează lanțul de acid poligalacturonic prin adaos de apă și sunt cele mai abundente dintre toate enzimele pectinolitice. Lilazele catalizează scindarea trans-eliminativă a polimerului de acid galacturonic. Pectinetazele eliberează pectine și metanol prin de-esterizarea legăturilor ester metilic din coloana vertebrală a pectinei .
După cum este prezentat în tabelul 15.1, s-a propus utilizarea SSF pentru producerea de pectinaze folosind diferite reziduuri agricole și agroindustriale solide ca substraturi . Ciupercile din genul Aspergillus sunt una dintre cele mai importante surse ale acestor enzime. Tașkin et al. au analizat mai multe tulpini de Aspergillus izolate din podgorii pentru producția de pectinază (poligalacturonază și polimetilgalacturonază) și au stabilit că SSF a fost mai bună decât SmF pentru producția de pectinază. În mod similar, Solis-Pereira et al. au determinat că fenomenele de reglare, cum ar fi inducția-reprimarea sau activarea-inhibiția legate de sinteza pectinazei de către A. niger CH4 sunt diferite în cele două tipuri de fermentație, ajungând la productivități globale ale SSF care au fost de 18,8 și 4,9 ori mai mari pentru endo- și, respectiv, exopectinază, decât cele din SmF. În plus, Acuña-Arguelles et al. au comparat proprietățile endo- și exopectinazei și ale pectinei lipazei produse prin tehnicile SSF și SmF din A. niger CH4. Aceștia au observat că proprietățile cinetice și fizico-chimice ale acestor enzime erau diferite în funcție de tipul de fermentare. Astfel, în SSF, toate activitățile pectinazei au fost mai stabile la valori extreme de pH și temperatură. În plus, studiul prin electroforeză al diferitelor extracte enzimatice obținute pentru ambele metode de cultură a arătat același număr de benzi proteice, dar cu unele diferențe în poziția lor electroforetică, ceea ce sugerează că metoda de cultură poate fi responsabilă de inducerea unor modificări în unele dintre enzimele pectinolitice produse de A. niger.
Selectarea unui suport adecvat pentru realizarea SFF este esențială, deoarece succesul procesului depinde de acesta. Suporturile SSF necesită caracteristici în raport cu compoziția chimică a deșeurilor (carbohidrați, sursă de azot, săruri minerale etc.) și cu proprietățile fizice ale acestora pentru o bună creștere a ciupercii filamentoase peste deșeuri. Fig. 15.3 arată modul în care ciuperca Trichoderma longibrachiatum se dezvoltă pe substratul solid și este evident că dimensiunea particulelor și porozitatea din substrat pot afecta modelul de curgere și distribuția nutrienților. Particulele mici sau particulele cu suprafețe plane mari au tendința de a se aduna strâns, ceea ce face dificilă aerisirea masei de substrat. În cazul în care microorganismul poate pătrunde în particule, acest lucru mărește substratul direct accesibil și scade distanța pe care trebuie să se producă difuzia. Prin urmare, dimensiunea optimă a particulelor reprezintă adesea un compromis între accesibilitatea nutrienților și disponibilitatea oxigenului .
Figura 15.3. Imagine de microscopie cu scanare electronică a Trichoderma longibrachiatum cultivată pe fibră de poliamidă utilizată ca suport în fermentația în stare solidă.
Pentru SSF, mai multe reziduuri din agroindustrii, cum ar fi coaja de portocală și coaja de lămâie, conțin o cantitate valoroasă de pectină, care acționează ca suport și inductor. Coaja de citrice, principalul subprodus solid al industriilor de prelucrare a fructelor, constituie aproximativ 50% din greutatea fructelor proaspete. Astfel, coaja de lămâie este principalul subprodus solid rezultat din industria de prelucrare a lămâilor și constituie aproximativ 19,8% din masa uscată a lămâii . Din acest motiv, eliminarea și gestionarea acestor reziduuri devine o problemă serioasă pentru industrii. Ca o alternativă la eliminarea cojilor, acestea pot fi utilizate ca substrat pentru producerea unor niveluri ridicate de enzime pectinolitice .
Ruiz et al. au studiat producția de pectinază de către opt tulpini fungice diferite din genurile Aspergillus și Penicillium în condiții de SSF, folosind ca substrat reziduuri de coajă de lămâie, A. niger Aa-20 fiind cea mai bună tulpină. Aceștia au determinat importanța selecției dimensiunii particulelor și au realizat SSF într-un bioreactor cu tăvi de tip coloană la 30°C, cu un conținut de umiditate de 70%, un debit de aer de 194 ml/min și o dimensiune a particulelor de substrat (2-0,7 mm) de tescovină de coajă de lămâie timp de 96 de ore. În aceste condiții au atins o activitate pectinazică maximă în jur de 2181 U/L, ceea ce sugerează că acest proces este o alternativă foarte promițătoare pentru producerea de pectinaze.
În mai multe studii s-a observat creșterea nivelului de producere a pectinazelor atunci când reziduurile agroindustriale au fost suplimentate cu surse suplimentare de carbon și azot. De exemplu, Patil și Dayanand au raportat că suplimentarea cu zaharoză din coaja de lămâie, tulpina de sorg și capul de floarea-soarelui pentru producerea de pectinază de către A. niger DMF 27 și A. niger DMF 45 în SSF a fost mai eficientă decât glucoza. Mai mult, ei au observat, de asemenea, că printre sursele de azot, sulfatul de amoniu a crescut nivelul de producție de pectinaze din toate substraturile .
Pe de altă parte, SSF a fost, de asemenea, realizat folosind un substrat convențional, cum ar fi tărâțele de grâu și suplimentat cu coajă de portocală ca inductor. Liu et al. au îmbunătățit producția de pectinază extracelulară de către o tulpină A. niger JL-15 recent izolată, optimizând condițiile de SSF prin metodologia suprafeței de răspuns. Activitatea maximă a pectinazei a fost de patru ori mai mare decât cea a mediului de bază, parametrii optimi fiind 12,10% pulbere de coajă de portocală, 3,20% sulfat de amoniu folosind tărâțe de grâu ca substrat solid, 51,10% conținut de umiditate și 75 h de fermentare. În mod similar, Li et al. au determinat că coaja de portocală și tărâțele de grâu au fost cele mai bune substraturi pentru producția de pectinază, iar Diaz et al. au demonstrat efectul pozitiv al utilizării unui amestec de tescovină de struguri și coji de portocale.
Există puține modele disponibile pentru bioreactoare care să funcționeze în SSF la o producție la scară largă de pectinază. Inițial, Huerta et al. au realizat SSF cu A. niger într-un bioreactor cu pat compact cu o capacitate de 10 până la 25 kg de materie uscată, folosind ca surse de carbon bagasa de trestie de zahăr impregnată cu o soluție nutritivă care conținea zaharoză și pectină de citrice. He și Chen au raportat că SSF gazoasă cu dublă dinamică a oferit avantaje mai mari decât SSF statică în prepararea enzimelor industriale, cum ar fi pectinaza, glucoamilaza, proteinaza și celuloza, datorită activităților enzimatice îmbunătățite și a timpului de fermentare mai scurt. În acest bioreactor de 800 L, mediul în stare solidă conținea 90% tărâțe de grâu, 5% tărâțe de orez, 2% pudră de coajă de citrice și 3% făină de porumb și s-au folosit diferite raporturi lichid-solid ale mediului (0,7, 1,0 și 1,3 (p/p)). Pitol et al. au evaluat producția de pectinază de către A. niger în timpul SSF în bioreactoare cu pat compact de la 12 g de materie uscată la scară de laborator la 20-30 kg de materie uscată la scară pilot. Pe baza informațiilor obținute, cum ar fi rata de consum de O2 și distribuția temperaturii și a activității pectinazei, autorii au propus o strategie viabilă pentru scalarea procesului la nivel industrial .
Utilizarea pectinazelor enzimatice extremofile (alcalofile, termostabile etc.) a atras o atenție considerabilă datorită potențialului pentru aplicații industriale. Astfel, stabilitatea și activitatea ridicată la temperaturi ridicate și în mediu alcalin au devenit proprietăți enzimatice dezirabile pentru prelucrarea industrială. Un nivel ridicat de pectinază alcalofilă a fost produsă de o tulpină izolată de B. subtilis în condiții de SSF folosind combinații de reziduuri agricole ieftine (tărâțe de grâu și turte de semințe de bumbac, tărâțe de grâu și deșeuri de citrice, tărâțe de grâu și frunze alfa-alfa, turte de semințe de bumbac și deșeuri de citrice, turte de semințe de bumbac și frunze alfa-alfa, deșeuri de citrice și frunze alfa-alfa, un amestec din cele patru substraturi) . Cu toate acestea, cele mai bune niveluri au fost obținute atunci când s-a folosit ca substrat un amestec de tărâțe de grâu și deșeuri de citrice cu un supliment de extract de drojdie, ceea ce este în concordanță cu studiile anterioare raportate anterior.
Enzimele termostabile pot fi produse de tulpini termofile, cum ar fi termofilul izolat, Thermoascus aurantiacus 179-5, care a fost capabil să producă niveluri ridicate de pectină liază și poligalacturonază în timpul SSF folosind ca surse de carbon bagasa de portocale și tărâțe de grâu. Aceste enzime au prezentat o temperatură optimă în jurul valorii de 65°C, cu o bună termostabilitate, în special pectina lipaza, care a fost stabilă timp de 5 ore la 60°C . Kaur și Saryanarayana au constatat că, dintre cele patru mucegaiuri termofile, Sporotrichum thermophile a produs o concentrație mare de xilanoze, pectinaze și celuloze după 4 zile de incubare în SSF. Combinațiile de agro-residuuri încercate au fost tărâțe de grâu și pectină de citrice într-un raport de 1:1. Într-un alt studiu, Martin et al. au izolat 34 de tulpini fungice termofile și termotolerante din sol, compost organic și deșeuri industriale folosind un mediu de cultură care conține pectină ca unică sursă de carbon. Toate aceste tulpini izolate, care au fost identificate la nivel de genuri ca fiind Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis și Thermomucor, au produs pectinază în timpul SSF. De exemplu, atunci când Thermomucor indicae seudaticae a fost cultivat în condiții de SSF pe medii care conțineau un amestec de tărâțe de grâu și bagasă de portocale (1:1) la 70% din umiditatea inițială, activitatea maximă a poligalacturonazei a fost de 120 U/mL, în timp ce în SmF a produs doar 13,6 U/mL.
.