Grupo heterogéneo
2.2 Pectinasas
Las pectinasas constituyen un grupo heterogéneo de enzimas que descomponen los polisacáridos complejos de los tejidos vegetales en moléculas más simples como los ácidos galacturónicos. Su aplicación comercial se observó por primera vez en 1930 para la preparación de vinos y zumos de frutas. Tienen una cuota del 25% en las ventas mundiales de enzimas alimentarias y se emplean industrialmente en la extracción, clarificación y concentración de zumos de frutas; la clarificación de vinos; y la extracción de aceites, sabores y pigmentos de las plantas . Estas enzimas incluyen las protopectinasas, las poligalacturonasas, las liasas y las pectinesterasas en función de su modo de acción. Las protopectinasas catalizan la solubilización de la protopectina. Las poligalacturonasas hidrolizan la cadena de ácido poligalacturónico por adición de agua y son las más abundantes entre todas las enzimas pectinolíticas. Las liasas catalizan la escisión trans-eliminativa del polímero de ácido galacturónico. Las pectinesterasas liberan pectinas y metanol mediante la desesterificación de los enlaces ésteres metílicos de la columna vertebral de la pectina.
Como se muestra en la Tabla 15.1, se ha propuesto el uso de SSF para la producción de pectinasas utilizando diferentes residuos sólidos agrícolas y agroindustriales como sustratos. Los hongos del género Aspergillus son una de las fuentes más importantes de estas enzimas. Taşkin et al. examinaron varias cepas de Aspergillus aisladas de viñedos para la producción de pectinasa (poligalacturonasa y polimetilgalacturonasa) y determinaron que SSF era mejor que SmF para la producción de pectinasa. Del mismo modo, Solís-Pereira et al. determinaron que los fenómenos de regulación, como la inducción-represión o la activación-inhibición relacionados con la síntesis de pectinasas por A. niger CH4 son diferentes en los dos tipos de fermentación, alcanzando productividades globales de SSF que fueron 18,8 y 4,9 veces mayores para endo y exopectinasa, respectivamente, que las de SmF. Además, Acuña-Arguelles et al. compararon las propiedades de la endo- y exopectinasa y de la pectina liasa producidas por las técnicas SSF y SmF a partir de A. niger CH4. Observaron que las propiedades cinéticas y fisicoquímicas de estas enzimas eran diferentes según el tipo de fermentación. Así, en SSF todas las actividades pectinasas eran más estables a valores extremos de pH y temperatura. Además, el estudio de electroforesis de los diferentes extractos enzimáticos obtenidos para ambos métodos de cultivo mostró el mismo número en bandas proteicas, pero con algunas diferencias en su posición electroforética que sugieren que el método de cultivo puede ser responsable de inducir cambios en algunas de las enzimas pectinolíticas producidas por A. niger.
La selección de un soporte adecuado para realizar la FFS es fundamental, ya que de ello depende el éxito del proceso. Los soportes de SSF requieren unas características en relación con la composición química de los residuos (carbohidratos, fuente de nitrógeno, sales minerales, etc.) y sus propiedades físicas para un buen crecimiento del hongo filamentoso sobre los residuos. La Fig. 15.3 muestra cómo crece el hongo Trichoderma longibrachiatum sobre el sustrato sólido y es evidente que el tamaño de las partículas y la porosidad del sustrato pueden afectar al patrón de flujo y a la distribución de nutrientes. Las partículas pequeñas, o con grandes superficies planas, tienden a empaquetarse estrechamente, lo que dificulta la aireación de la masa de sustrato. Si el microorganismo puede penetrar en la partícula, esto aumenta el sustrato directamente accesible y disminuye la distancia a la que debe producirse la difusión. Por lo tanto, el tamaño óptimo de las partículas suele representar un compromiso entre la accesibilidad de los nutrientes y la disponibilidad de oxígeno.
Figura 15.3. Imagen de microscopía de barrido electrónico de Trichoderma longibrachiatum cultivada en fibra de poliamida utilizada como soporte en la fermentación en estado sólido.
Para la SSF, varios residuos de agroindustrias como la cáscara de naranja y la cáscara de limón contienen una valiosa cantidad de pectina, que actúa como soporte e inductor. La cáscara de los cítricos, el principal subproducto sólido de las industrias de transformación de la fruta, constituye aproximadamente el 50% del peso de la fruta fresca. Así, la cáscara de limón es el principal subproducto sólido resultante de la industria de transformación del limón y constituye alrededor del 19,8% de la masa seca del limón . Por esta razón, la eliminación y gestión de estos residuos se convierte en un grave problema para las industrias. Como alternativa a la eliminación de las cáscaras, éstas pueden ser utilizadas como sustrato para la producción de altos niveles de enzimas pectinolíticas.
Ruiz et al. estudiaron la producción de pectinasa por ocho cepas fúngicas diferentes de los géneros Aspergillus y Penicillium bajo SSF utilizando como sustrato orujo de cáscara de limón siendo A. niger Aa-20 la mejor cepa. Determinaron la importancia de la selección del tamaño de partícula y llevaron a cabo la SSF en un biorreactor de bandeja de columna a 30°C, 70% de contenido de humedad, 194 mL/min de velocidad de flujo de aire y tamaño de partícula del sustrato (2-0,7 mm) de orujo de cáscara de limón durante 96 h. En estas condiciones alcanzaron una actividad máxima de pectinasa alrededor de 2181 U/L, lo que sugiere este proceso como una alternativa muy prometedora para la producción de pectinasas.
En varios estudios se observó el aumento del nivel en la producción de pectinasas cuando los residuos agroindustriales fueron complementados con fuentes adicionales de carbono y nitrógeno. Por ejemplo, Patil y Dayanand informaron de que la suplementación de sacarosa en la cáscara de limón, el tallo de sorgo y la cabeza de girasol para la producción de pectinasa por A. niger DMF 27 y A. niger DMF 45 en SSF era más eficaz que la glucosa. Además, también observaron que, entre las fuentes de nitrógeno, el sulfato de amonio elevó el nivel de producción de pectinasas a partir de todos los sustratos.
Por otra parte, la SSF también se llevó a cabo utilizando un sustrato convencional como el salvado de trigo y complementado con cáscara de naranja como inductor. Liu et al. mejoraron la producción de pectinasa extracelular mediante una cepa de A. niger JL-15 recién aislada, optimizando las condiciones de SSF mediante la metodología de superficie de respuesta. La actividad máxima de la pectinasa fue cuatro veces mayor que la del medio básico siendo los parámetros óptimos 12,10% de polvo de cáscara de naranja, 3,20% de sulfato de amonio empleando salvado de trigo como sustrato sólido, 51,10% de contenido de humedad y 75 h de fermentación. Del mismo modo, Li et al. determinaron que la cáscara de naranja y el salvado de trigo eran los mejores sustratos para la producción de pectinasa y Díaz et al. demostraron el efecto positivo de utilizar una mezcla de orujo de uva y cáscaras de naranja.
Hay pocos diseños disponibles para biorreactores que operen en SSF en una producción a gran escala de pectinasa. Inicialmente, Huerta et al. llevaron a cabo la SSF con A. niger en un biorreactor de lecho empacado con una capacidad de 10 a 25 kg de materia seca utilizando como fuentes de carbono bagazo de caña de azúcar impregnado con una solución nutritiva que contenía sacarosa y pectina de cítricos. He y Chen informaron de que la SSF doblemente dinámica ofrecía mayores ventajas que la SSF estática en la preparación de enzimas industriales como la pectinasa, la glucoamilasa, la proteasa y la celulosa, debido a la mejora de las actividades enzimáticas y a la reducción del tiempo de fermentación. En este biorreactor de 800 L, el medio en estado sólido contenía un 90% de salvado de trigo, un 5% de salvado de arroz, un 2% de polvo de cáscara de cítricos y un 3% de harina de maíz, y se utilizaron diferentes relaciones líquido-sólido del medio (0,7, 1,0 y 1,3 (p/p)). Pitol et al. escalaron la producción de pectinasa por parte de A. niger durante la FLA en biorreactores de lecho compacto desde 12 g de materia seca a escala de laboratorio hasta 20-30 kg de materia seca a escala piloto. A partir de la información obtenida, como la tasa de consumo de O2 y la distribución de la temperatura y la actividad de la pectinasa, los autores propusieron una estrategia viable para escalar el proceso hasta el nivel industrial.
El uso de pectinasas de enzimas extremófilas (alcalófilas, termoestables, etc.) ha atraído una atención considerable debido a su potencial para aplicaciones industriales. Así, una alta estabilidad y actividad a alta temperatura y en un entorno alcalino se han convertido en propiedades enzimáticas deseables para el procesamiento industrial. Se produjo un alto nivel de pectinasa alcalófila a partir de una cepa aislada de B. subtilis bajo SSF utilizando combinaciones de residuos agrícolas baratos (salvado de trigo y torta de semillas de algodón, salvado de trigo y residuos de cítricos, salvado de trigo y hojas alfa-alfa, torta de semillas de algodón y residuos de cítricos, torta de semillas de algodón y hojas alfa-alfa, residuos de cítricos y hojas alfa-alfa, una mezcla de los cuatro sustratos) . Sin embargo, los mejores niveles se obtuvieron cuando se utilizó como sustrato una mezcla de salvado de trigo y residuos de cítricos con un suplemento de extracto de levadura, lo que concuerda con los estudios anteriores comunicados antes.
Las enzimas termoestables pueden ser producidas por cepas termófilas como el termófilo aislado, Thermoascus aurantiacus 179-5, que fue capaz de producir altos niveles de pectina liasa y poligalacturonasa durante el SSF utilizando bagazo de naranja y salvado de trigo como fuentes de carbono. Estas enzimas presentaron una temperatura óptima en torno a los 65°C con una buena termoestabilidad, especialmente la pectina liasa, que fue estable durante 5 horas a 60°C . Kaur y Saryanarayana descubrieron que, entre los cuatro mohos termófilos, Sporotrichum thermophile produjo una alta concentración de xilanasas, pectinasas y celulasas tras 4 días de incubación en SSF. Las combinaciones de agro-residuos probadas fueron salvado de trigo y pectina de cítricos en una proporción de 1:1. En otro estudio, Martin et al. aislaron 34 cepas de hongos termófilos y termotolerantes del suelo, el compost orgánico y los residuos industriales utilizando un medio de cultivo que contenía pectina como única fuente de carbono. Todas estas cepas aisladas, que fueron identificadas a nivel de género como Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis, y Thermomucor, produjeron pectinasa durante el SSF. Por ejemplo, cuando Thermomucor indicae seudaticae se cultivó en condiciones de SSF en medios que contenían una mezcla de salvado de trigo y bagazo de naranja (1:1) al 70% de la humedad inicial, la actividad máxima de la poligalacturonasa fue de 120 U/mL, mientras que en SmF sólo produjo 13,6 U/mL.