Heterogeeninen ryhmä
2.2 Pektinaasit
Pektinaasit muodostavat heterogeenisen ryhmän entsyymejä, jotka hajottavat kasvikudosten monimutkaisia polysakkarideja yksinkertaisemmiksi molekyyleiksi, kuten galakturonihapoiksi. Niiden kaupallinen käyttö havaittiin ensimmäisen kerran vuonna 1930 viinien ja hedelmämehujen valmistuksessa. Niiden osuus elintarvike-entsyymien maailmanlaajuisesta myynnistä on 25 prosenttia, ja niitä käytetään teollisesti hedelmämehujen uuttamisessa, selkeyttämisessä ja tiivistämisessä, viinien selkeyttämisessä sekä öljyjen, aromien ja pigmenttien uuttamisessa kasveista . Näihin entsyymeihin kuuluvat protopektinaasit, polygalakturonaasit, lyaasit ja pektiiniesteraasit niiden toimintatavan perusteella. Protopektinaasit katalysoivat protopektiinin liukenemista. Polygalakturonaasit hydrolysoivat polygalakturonihappoketjun vettä lisäämällä, ja ne ovat kaikista pektinolyyttisistä entsyymeistä runsaimpia. Ljaasit katalysoivat galakturonihappopolymeerin trans-eliminatiivista pilkkomista. Pektiiniesteraasit vapauttavat pektiinejä ja metanolia poistamalla pektiinin selkärangan metyyliesterisidoksia esteröimällä .
Kuten taulukossa 15.1 on esitetty, SSF:n käyttöä pektiiniaasin tuotantoon on ehdotettu käyttämällä substraatteina erilaisia kiinteitä maatalous- ja maatalousteollisuuden jätteitä . Aspergillus-suvun sienet ovat yksi tärkeimmistä näiden entsyymien lähteistä. Taşkin et al. seuloivat useita viinitarhoilta eristettyjä Aspergillus-kantoja pektinaasituotannon (polygalakturonaasi ja polymetyyligalakturonaasi) osalta ja totesivat, että SSF oli parempi kuin SmF pektinaasituotannossa. Vastaavasti Solis-Pereira et al. totesivat, että A. niger CH4:n pektinaasisynteesiin liittyvät säätelyilmiöt, kuten induktio-suppressio- tai aktivointi-inhibitio-ilmiöt, ovat erilaiset näissä kahdessa fermentaatiotyypissä, ja he saavuttivat SSF:ssä 18,8 kertaa suuremman endo- ja 4,9 kertaa suuremman endo- ja eksopektinaasin kokonaistuottavuuden kuin SmF:ssä. Lisäksi Acuña-Arguelles et al. vertasivat A. niger CH4:stä SSF- ja SmF-tekniikoilla tuotetun endo- ja eksopektinaasin sekä pektiinilyaasin ominaisuuksia. He havaitsivat, että näiden entsyymien kineettiset ja fysikaalis-kemialliset ominaisuudet olivat erilaiset fermentointitavasta riippuen. Näin ollen SSF:ssä kaikki pektinaasiaktiivisuudet olivat vakaampia äärimmäisissä pH- ja lämpötila-arvoissa. Lisäksi molemmilla viljelymenetelmillä saatujen erilaisten entsyymiuutteiden elektroforeesitutkimus osoitti saman määrän proteiinikaistoja, mutta niiden elektroforeettisessa sijainnissa oli joitakin eroja, mikä viittaa siihen, että viljelymenetelmä saattaa aiheuttaa muutoksia joissakin A. nigerin tuottamissa pektinolyyttisissä entsyymeissä.
Tarkoituksenmukaisen tukikappaleen valitseminen SFF:n suorittamista varten on olennaista, koska prosessin onnistuminen riippuu siitä. SSF-substraatit vaativat ominaisuuksia, jotka liittyvät jätteen kemialliseen koostumukseen (hiilihydraatit, typen lähde, mineraalisuolat jne.) ja sen fysikaalisiin ominaisuuksiin, jotta filamenttisieni voisi kasvaa hyvin jätteen päällä. Kuvassa 15.3 esitetään, miten Trichoderma longibrachiatum -sieni kasvaa kiinteällä alustalla, ja on ilmeistä, että alustan hiukkaskoko ja huokoisuus voivat vaikuttaa virtauskuvioon ja ravinteiden jakautumiseen. Pienet hiukkaset tai hiukkaset, joilla on suuri tasainen pinta, pakkautuvat yleensä tiiviisti yhteen, mikä vaikeuttaa substraattimassan ilmastamista. Jos mikro-organismi pääsee tunkeutumaan hiukkasen sisään, tämä lisää suoraan saatavilla olevan substraatin määrää ja pienentää matkaa, jonka yli diffuusion on tapahduttava. Siksi optimaalinen partikkelikoko on usein kompromissi ravinteiden saatavuuden ja hapen saatavuuden välillä .
Kuva 15.3. Elektroniikkamikroskopiakuva Trichoderma longibrachiatumista, jota on kasvatettu polyamidikuidulla, jota käytetään tukiaineena kiinteän olomuodon fermentoinnissa.
Kiinteän olomuodon fermentoinnissa useat maatalousteollisuuden jäämät, kuten appelsiininkuori ja sitruunankuori, sisältävät arvokkaan määrän pektiiniä, joka toimii tukiaineena ja indusorina. Sitrushedelmien kuori, joka on hedelmänjalostusteollisuuden tärkein kiinteä sivutuote, muodostaa noin 50 prosenttia tuoreiden hedelmien painosta. Sitruunan kuori on siis tärkein sitruunanjalostusteollisuuden kiinteä sivutuote, ja sen osuus sitruunan kuivapainosta on noin 19,8 prosenttia. Tästä syystä näiden jätteiden hävittämisestä ja käsittelystä tulee vakava ongelma teollisuudelle. Vaihtoehtona kuorien hävittämiselle niitä voidaan käyttää substraattina korkeiden pektinolyyttisten entsyymien tuotantoon.
Ruiz et al. tutkivat kahdeksan eri Aspergillus- ja Penicillium-sukujen sienikannan pektinaasituotantoa SSF-menetelmällä käyttäen substraattina sitruunan kuoren puristemassaa, joista A. niger Aa-20 oli paras kanta. He määrittivät partikkelikoon valinnan merkityksen ja suorittivat SSF:n kolonnikaukalo-bioreaktorissa 30 °C:ssa, 70 %:n kosteuspitoisuudessa, 194 ml/min ilmavirran nopeudella ja substraatin partikkelikoolla (2-0,7 mm), joka oli sitruunankuoren puristemassa, 96 tunnin ajan. Näissä olosuhteissa saavutettiin pektinaasiaktiivisuuden maksimi noin 2181 U/L, mikä viittaa siihen, että tämä prosessi on erittäin lupaava vaihtoehto pektinaasituotannolle.
Monissa tutkimuksissa havaittiin pektinaasituotannon tason nousua, kun maatalousteollisuuden jätteisiin lisättiin ylimääräisiä hiili- ja typenlähteitä. Esimerkiksi Patil ja Dayanand raportoivat, että sakkaroosin lisääminen sitruunankuoriin, durran varsiin ja auringonkukan päihin A. niger DMF 27:n ja A. niger DMF 45:n pektinaasituotannossa SSF:ssä oli glukoosia tehokkaampaa. Lisäksi he huomasivat, että typenlähteistä ammoniumsulfaatti nosti pektinaasien tuotantotasoa kaikista substraateista .
Toisaalta SSF:ssä käytettiin myös tavanomaista substraattia, kuten vehnälesejä, ja sitä täydennettiin indusoijana appelsiininkuorella. Liu et al. paransivat solunulkoisen pektinaasin tuotantoa äskettäin eristetyllä A. niger JL-15 -kannalla optimoimalla SSF:n olosuhteet vastepintamenetelmän avulla. Suurin pektinaasiaktiivisuus oli neljä kertaa suurempi kuin perusympäristössä, kun optimaaliset parametrit olivat 12,10 % appelsiininkuorijauhetta, 3,20 % ammoniumsulfaattia, jossa vehnäleseet toimivat kiinteänä substraattina, 51,10 %:n kosteuspitoisuus ja 75 tunnin käyminen. Vastaavasti Li et al. totesivat, että appelsiininkuoret ja vehnäleseet olivat parhaita substraatteja pektinaasituotannossa, ja Diaz et al. osoittivat, että viinirypäleen puristemassan ja appelsiininkuorien seoksen käytöllä oli myönteinen vaikutus.
Pektinaasin laajamittaiseen tuotantoon SSF-menetelmällä toimivista bioreaktoreista on saatavilla vain vähän malleja. Aluksi Huerta et al. käyttivät A. nigerin kanssa SSF-menetelmää pakatussa bioreaktorissa, jonka kapasiteetti oli 10-25 kg kuiva-ainetta ja jossa käytettiin hiililähteenä sokeriruoko-bagassia, joka oli kyllästetty ravinneliuoksella, joka sisälsi sakkaroosia ja sitrushedelmäpektiiniä. Hän ja Chen raportoivat, että kaasun kaksoisdynaaminen SSF tarjosi suurempia etuja staattiseen SSF:ään verrattuna teollisten entsyymien, kuten pektinaasin, glukoamylaasin, proteaasin ja selluloosan valmistuksessa, koska entsyymiaktiivisuus parani ja fermentointiaika lyheni. Tässä 800 litran bioreaktorissa kiinteän tilan väliaine sisälsi 90 % vehnäleseet, 5 % riisileseet, 2 % sitrushedelmien kuorijauhetta ja 3 % maissijauhoa, ja väliaineessa käytettiin erilaisia nesteen ja kiinteän aineen suhteita (0,7, 1,0 ja 1,3 (w/w)). Pitol et al. skaalasivat A. nigerin pektinaasituotannon SSF:n aikana pakattujen sänkyjen bioreaktoreissa 12 grammasta kuiva-ainetta laboratoriomittakaavassa 20-30 kilogrammaan kuiva-ainetta pilottimittakaavassa. Saatujen tietojen, kuten O2:n kulutusnopeuden sekä lämpötilan ja pektinaasiaktiivisuuden jakauman perusteella kirjoittajat ehdottivat toteuttamiskelpoista strategiaa prosessin skaalaamiseksi teolliseen tasoon.
Erittäin piilevien entsyymien (alkalofiiliset, termostabiilit jne.) pektinaasien käyttö on herättänyt huomattavaa huomiota potentiaalisten teollisten sovellusten vuoksi. Korkeassa lämpötilassa ja emäksisessä ympäristössä tapahtuvasta korkeasta stabiilisuudesta ja aktiivisuudesta on tullut toivottavia entsyymin ominaisuuksia teollista prosessointia varten. Eristetystä B. subtilis -kannasta tuotettiin runsaasti alkalofiilistä pektinaasia SSF-menetelmällä, jossa käytettiin halpojen maatalousjätteiden yhdistelmiä (vehnäleseet ja puuvillansiemenkakku, vehnäleseet ja sitrushedelmäjäte, vehnäleseet ja alfa-alfa-lehdet, puuvillansiemenkakku ja sitrushedelmäjäte, puuvillansiemenkakku ja alfa-alfa-lehdet, sitrushedelmäjäte ja alfa-alfa-lehdet, neljän substraatin sekoitus). Parhaat tasot saatiin kuitenkin, kun substraattina käytettiin vehnäleseiden ja sitrushedelmäjätteen seosta, johon oli lisätty hiivauutetta, mikä on linjassa aiemmin raportoitujen aiempien tutkimusten kanssa.
Termostabiileja entsyymejä voivat tuottaa termofiiliset kannat, kuten eristetty termofiili Thermoascus aurantiacus 179-5, joka kykeni tuottamaan korkeita määriä pektiinilyaasia ja polygalakturonaasia SSF:ssä, jossa käytettiin appelsiinibagassia ja vehnälesejä hiililähteinä. Näiden entsyymien optimilämpötila oli noin 65 °C ja termostabiilisuus oli hyvä, erityisesti pektiinilyaasin, joka oli stabiili 5 tuntia 60 °C:ssa. Kaur ja Saryanarayana havaitsivat, että neljästä termofiilisestä homeesta Sporotrichum thermophile tuotti suuria pitoisuuksia ksylanaaseja, pektinaaseja ja sellulaaseja neljän päivän inkuboinnin jälkeen SSF:ssä. Kokeillut maatalousjätteiden yhdistelmät olivat vehnäleseet ja sitruspektiini suhteessa 1:1. Toisessa tutkimuksessa Martin et al. eristivät 34 termofiilistä ja termotoleranttia sienikantaa maaperästä, orgaanisesta kompostista ja teollisuusjätteestä käyttäen kasvualustaa, joka sisälsi pektiiniä ainoana hiililähteenä. Kaikki nämä eristetyt kannat, jotka tunnistettiin suvun tasolla Thermomyces-, Aspergillus-, Monascus-, Chaetomium-, Neosartoria-, Scopulariopsis- ja Thermomucor-suvuiksi, tuottivat pektinaasia SSF:n aikana. Esimerkiksi kun Thermomucor indicae seudaticae -kasvintuhoojaa viljeltiin SSF-olosuhteissa väliaineessa, joka sisälsi vehnäleseiden ja appelsiinibagassin seosta (1:1) 70 %:n alkukosteudessa, polygalakturonaasin maksimiaktiivisuus oli 120 U/ml, kun taas SmF:ssä se tuotti vain 13,6 U/ml.