Gruppo eterogeneo
2.2 Pectinasi
Le pectinasi costituiscono un gruppo eterogeneo di enzimi che scompongono polisaccaridi complessi dei tessuti vegetali in molecole più semplici come gli acidi galatturonici. La loro applicazione commerciale è stata osservata per la prima volta nel 1930 per la preparazione di vini e succhi di frutta. Hanno una quota del 25% nelle vendite globali di enzimi alimentari e sono industrialmente impiegati nell’estrazione, chiarificazione e concentrazione di succhi di frutta; la chiarificazione dei vini; e l’estrazione di oli, sapori e pigmenti dalle piante. Questi enzimi includono protopectinasi, poligalatturonasi, liasi e pectinesterasi in base alla loro modalità di azione. Le protopectinasi catalizzano la solubilizzazione della protopectina. Le poligalatturonasi idrolizzano la catena dell’acido poligalatturonico per aggiunta di acqua e sono le più abbondanti tra tutti gli enzimi pectinolitici. Le lisi catalizzano la scissione trans-eliminativa del polimero dell’acido galatturonico. Le pectinesterasi liberano pectine e metanolo de-esterificando i legami metil esteri della spina dorsale della pectina.
Come illustrato nella tabella 15.1, l’uso della SSF per la produzione di pectinasi è stato proposto utilizzando diversi residui solidi agricoli e agro-industriali come substrati. I funghi del genere Aspergillus sono una delle fonti più importanti di questi enzimi. Taşkin et al. hanno esaminato diversi ceppi di Aspergillus isolati da vigneti per la produzione di pectinasi (poligalatturonasi e polimetilgalatturonasi) e hanno determinato che SSF era migliore di SmF per la produzione di pectinasi. Allo stesso modo, Solis-Pereira et al. hanno determinato che i fenomeni regolatori, come l’induzione-repressione o l’attivazione-inibizione relativi alla sintesi di pectinasi da A. niger CH4 sono diversi nei due tipi di fermentazione, raggiungendo produttività complessive di SSF che erano 18,8 e 4,9 volte superiori per l’endo- ed esopectinasi, rispettivamente, rispetto a quelle in SmF. Inoltre, Acuña-Arguelles et al. hanno confrontato le proprietà dell’endo- ed esopectinasi e della pectina liasi prodotte con tecniche SSF e SmF da A. niger CH4. Hanno osservato che le proprietà cinetiche e fisico-chimiche di questi enzimi erano diverse a seconda del tipo di fermentazione. Così, in SSF tutte le attività di pectinasi erano più stabili a valori estremi di pH e temperatura. Inoltre, lo studio di elettroforesi dei diversi estratti enzimatici ottenuti per entrambi i metodi di coltura ha mostrato lo stesso numero di bande proteiche, ma con alcune differenze nella loro posizione elettroforetica che suggerisce che il metodo di coltura può essere responsabile dell’induzione di cambiamenti in alcuni degli enzimi pectinolitici prodotti da A. niger.
La selezione di un supporto adeguato per eseguire la SFF è essenziale, poiché il successo del processo dipende da questo. I substrati SSF richiedono caratteristiche in relazione alla composizione chimica del rifiuto (carboidrati, fonte di azoto, sali minerali, ecc.) e le sue proprietà fisiche per una buona crescita del fungo filamentoso sul rifiuto. La Fig. 15.3 mostra come il fungo Trichoderma longibrachiatum cresce sul substrato solido ed è ovvio che la dimensione delle particelle e la porosità del substrato possono influenzare il modello di flusso e la distribuzione dei nutrienti. Le particelle piccole, o le particelle con grandi superfici piane, tendono a impacchettare strettamente insieme, rendendo difficile l’aerazione della massa del substrato. Se il microrganismo può penetrare nella particella, questo aumenta il substrato direttamente accessibile e diminuisce la distanza su cui la diffusione deve avvenire. Pertanto, la dimensione ottimale delle particelle rappresenta spesso un compromesso tra l’accessibilità dei nutrienti e la disponibilità di ossigeno.
Figura 15.3. Immagine al microscopio a scansione elettronica di Trichoderma longibrachiatum coltivato su fibra di poliammide usata come supporto nella fermentazione allo stato solido.
Per la SSF, diversi residui dell’agroindustria come la buccia d’arancia e di limone contengono una preziosa quantità di pectina, che agisce come supporto e induttore. La buccia degli agrumi, il principale sottoprodotto solido delle industrie di trasformazione della frutta, costituisce circa il 50% del peso della frutta fresca. Così, la buccia di limone è il principale sottoprodotto solido derivante dall’industria di trasformazione del limone e costituisce circa il 19,8% della massa secca del limone. Per questo motivo, lo smaltimento e la gestione di questi residui diventa un serio problema per le industrie. In alternativa allo smaltimento delle bucce, queste possono essere utilizzate come substrato per la produzione di alti livelli di enzimi pectinolitici.
Ruiz et al. hanno studiato la produzione di pectinasi da parte di otto diversi ceppi fungini dei generi Aspergillus e Penicillium in SSF utilizzando come substrato la sansa di buccia di limone, con A. niger Aa-20 come ceppo migliore. Hanno determinato l’importanza della selezione della dimensione delle particelle e hanno eseguito la SSF in un bioreattore a colonna a 30°C, 70% di umidità, 194 mL/min di flusso d’aria e dimensione delle particelle del substrato (2-0,7 mm) di sansa di limone per 96 ore. In queste condizioni hanno raggiunto un’attività massima di pectinasi intorno a 2181 U/L, il che suggerisce questo processo come un’alternativa molto promettente per la produzione di pectinasi.
In diversi studi è stato notato l’aumento del livello di produzione di pectinasi quando i residui agro-industriali sono stati integrati con ulteriori fonti di carbonio e azoto. Per esempio, Patil e Dayanand hanno riportato che l’integrazione di saccarosio nella buccia di limone, nel gambo di sorgo e nella testa di girasole per la produzione di pectinasi da A. niger DMF 27 e A. niger DMF 45 in SSF era più efficace del glucosio. Inoltre, hanno anche notato che tra le fonti di azoto, il solfato di ammonio ha aumentato il livello di produzione di pectinasi da tutti i substrati.
D’altra parte, la SSF è stata anche eseguita utilizzando un substrato convenzionale come la crusca di grano e integrata con buccia d’arancia come induttore. Liu et al. hanno migliorato la produzione di pectinasi extracellulare da un ceppo di A. niger JL-15 appena isolato, ottimizzando le condizioni della SSF con la metodologia della superficie di risposta. L’attività massima di pectinasi era quattro volte più alta di quella del mezzo di base, essendo i parametri ottimali 12,10% di polvere di buccia d’arancia, 3,20% di solfato d’ammonio che impiega crusca di grano come substrato solido, 51,10% di umidità e 75 ore di fermentazione. Allo stesso modo Li et al. hanno determinato che le bucce d’arancia e la crusca di grano erano i migliori substrati per la produzione di pectinasi e Diaz et al. hanno dimostrato l’effetto positivo di usare una miscela di vinacce e bucce d’arancia.
Ci sono pochi disegni disponibili per bioreattori che operano in SSF su una produzione su larga scala di pectinasi. Inizialmente Huerta et al. hanno condotto la SSF con A. niger in un bioreattore a letto imballato con una capacità da 10 a 25 kg di materia secca usando come fonti di carbonio la bagassa di canna da zucchero impregnata con una soluzione nutritiva che conteneva saccarosio e pectina di agrumi. Lui e Chen hanno riferito che la SSF a gas a doppia dinamica ha offerto maggiori vantaggi rispetto alla SSF statica nella preparazione di enzimi industriali come pectinasi, glucoamilasi, proteasi e cellulosa, grazie alle migliori attività enzimatiche e al tempo di fermentazione ridotto. In questo bioreattore da 800 L il mezzo allo stato solido conteneva il 90% di crusca di grano, il 5% di crusca di riso, il 2% di polvere di buccia di agrumi e il 3% di farina di mais, e sono stati utilizzati diversi rapporti liquido-solido del mezzo (0,7, 1,0 e 1,3 (w/w)). Pitol et al. hanno scalato la produzione di pectinasi da A. niger durante la SSF in bioreattori a letto pieno da 12 g di materia secca su scala di laboratorio a 20-30 kg di materia secca su scala pilota. Dalle informazioni ottenute, come il tasso di consumo di O2 e la distribuzione della temperatura e dell’attività della pectinasi, gli autori hanno proposto una strategia praticabile per scalare il processo fino al livello industriale.
L’uso di enzimi estremofili (alcalofili, termostabili, ecc.) pectinasi ha attirato una notevole attenzione a causa del potenziale per applicazioni industriali. Così l’alta stabilità e l’attività ad alta temperatura e in ambiente alcalino sono diventate proprietà enzimatiche desiderabili per la lavorazione industriale. Un alto livello di pectinasi alcalofila è stato prodotto da un ceppo isolato di B. subtilis sotto SSF usando combinazioni di residui agricoli economici (crusca di grano e panelli di semi di cotone, crusca di grano e rifiuti di agrumi, crusca di grano e foglie alfa-alfa, panelli di semi di cotone e rifiuti di agrumi, panelli di semi di cotone e foglie alfa-alfa, rifiuti di agrumi e foglie alfa-alfa, una miscela dei quattro substrati) . Tuttavia, i livelli migliori sono stati ottenuti quando è stata utilizzata come substrato una miscela di crusca di grano e rifiuti di agrumi con un supplemento di estratto di lievito, il che è in accordo con gli studi precedenti riportati in precedenza.
Gli enzimi termostabili possono essere prodotti da ceppi termofili come il termofilo isolato, Thermoascus aurantiacus 179-5, che è stato in grado di produrre alti livelli di pectina liasi e poligalatturonasi durante la SSF utilizzando bagassa d’arancia e crusca di grano come fonti di carbonio. Questi enzimi hanno presentato una temperatura ottimale intorno ai 65°C con una buona termostabilità, specialmente la pectina liasi, che era stabile per 5 ore a 60°C. Kaur e Saryanarayana hanno scoperto che tra le quattro muffe termofile, Sporotrichum thermophile ha prodotto un’alta concentrazione di xilanasi, pectinasi e cellulasi dopo 4 giorni di incubazione in SSF. Le combinazioni di agro-residui provate erano crusca di grano e pectina di agrumi in un rapporto di 1:1. In un altro studio, Martin et al. hanno isolato 34 ceppi fungini termofili e termotolleranti dal suolo, dal compost organico e dai rifiuti industriali utilizzando un mezzo di coltura contenente pectina come unica fonte di carbonio. Tutti questi ceppi isolati, che sono stati identificati a livello di genere come Thermomyces, Aspergillus, Monascus, Chaetomium, Neosartoria, Scopulariopsis, e Thermomucor, hanno prodotto pectinasi durante la SSF. Per esempio, quando Thermomucor indicae seudaticae è stato coltivato in condizioni di SSF su mezzi contenenti una miscela di crusca di grano e bagassa d’arancia (1:1) al 70% dell’umidità iniziale, l’attività massima di poligalatturonasi è stata di 120 U/mL, mentre in SmF ha prodotto solo 13,6 U/mL.